摘要：目的研究牛IgGFc受体的结 构与功能的关系。方法在构建了牛肺巨噬细胞cDNA文库的基础上，用PCR方法获得了编码牛IgG Fc受体Ⅲ（boFcγRⅢ）的全长编码基因。结果通过分子克隆和序列分析，发现其 编码基因为507bp，共编码168个氨基酸，其中含有信号肽序列、穿膜区和胞内结构 域以及3个N-连接糖基化位点。与COLLINS等克隆的boFcγRⅢ相比，在它的 胞外区中缺失了82个氨基酸，仅有一个胞外结构域。结论 我们所克隆的cDNA片段属于编码牛的FcγRⅢA（CD16-Ⅱ）一种特殊的 基因结构形式。

中图分类号：S852.4；Q78文献标识码：A

Molecular cloning and sequence analysis of bovine IgG Fc receptor type

YAN Yu-he，ZHANG Gai-ping，LI Xue- wu，LI Qing-mei

（Institute of Animal and Veterin ary Sciences，Henan Academy of Agricultur al Sciences，Zhengzhou 450002，China）

Abstract：ObjectiveIn order to investigate the structural and functional relation of bovine IgG Fc rec eptor．MethodsThe full lengt h of gene encoding Fc receptor type Ⅲ fo r bovine IgG（boFcγRⅢ，CD16）） was obtained with PCR from the cDNA library of bov ine alveolar macrophage．ResultsIt is shown through molecular c loning and sequen-cing that the coding gene has 507 bp and codes for 168 amino acids． There are gene sequence coding signal pe ptide，transmembrane and intracellular re gions．It als o has 3 potential N-linked glycosylation site s．Compared with the boFcγRⅢ cDNA cloned by COLLINS et al，the sequence deletes 82 amino acids and has only one extracellu lar domain．ConclusionIt is suggested that this cDN A fragment may be a special form of the gene structure of bovine FcγRⅢA（CD16-Ⅱ）．

Key words：bovine FcγRⅢ （ CD16）；molecular cloning；sequence analysis▲

免疫球蛋白G（IgG）Fc段的特异性受体（FcγR）属于Ig基因的超家族成员。人和哺乳动物的IgG Fc受体主要包括3种类型，即FcγRI、FcγRⅡ和FcγR Ⅲ，它们又分别被称为CD64、CD32和CD16。虽然这些受体与各自的配体（Ig G亚类）的亲和力不同，但在体内所发挥的功能相似，如参与机体对异物的识别和清除、抗 体依赖性细胞毒作用（ADCC）、抗原的处理和提呈、免疫球蛋白的分泌、细胞因子的产 生以及免疫应答的调控和信号转导等^［1～3］。因此，它们在诱发机体的细胞免疫 和体液免疫方面起着十分重要的作用。研究这些受体的结构，对于进一步了解它们各自在体 内所发挥的作用以及结构与功能的关系，具有重要意义。

目前有关人和小鼠IgG Fc受体的研究较为深入，不但对编码这3类受体的基因进行了 克隆和测序，而且还在染色体中进行了定位，对其功能的研究也在进行之中^［4～7］ 。由于反刍类动物所具有的不同于其它哺乳类的组织解剖学特点，因此在表现对病原体 的抵抗力（免疫力）方面也有其自身的特点，而动物的IgG Fc受体与其抗病能力有直 接相关性。为此，我们以牛作为反刍类的代表，对牛FcγRⅢ（boFcγRⅢ）的结构 基因进行了克隆和序列分析。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1牛肺巨噬细胞：采自于健康屠宰牛的肺脏。

1.1.2菌株和质粒：大肠杆菌MC1061／P3和质粒pCDM8来源于 Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α由本室保存；质粒pUC19购自华美生物 工程公司。

1.2方法

1.2.1总RNA提取和mRNA的分离：按照文献［8］的方法，先用Cs Cl作垫层的梯度离心法提取牛肺巨噬细胞的总RNA，再用Oligo（dT）纤维柱分离mRNA^［9］。

1.2.2cDNA文库的构建：用随机引物将提取的mRNA反转录为 cDNA，加T4聚合酶补平，再将含有BstXI酶切位点的接头连接到cDNA的两 端；同时用BstXI酶切质粒pCDM8，回收大片段，然后用修饰过的cDNA与pC DM8大片段连接，转化大肠杆菌MC1061／P3，构成cDNA文库。

1.2.3PCR引物的设计及合成：参照COllINS等^［10］ 发表的从牛 肠系膜淋巴结的单核细胞中获得的FcγRⅢ的基因序列（注册号X99695），用Ol igo引物分析软件设计1对引物，上游引物为5’-CACTCTAACACACA GCATGT，下游引物是5’-TGGGTGAAGGATCCTCAGAT，后者 含有BamHI酶切位点。

1.2.4PCR扩增条件及其产物的鉴定：取cDNA文库4μl，加dNTP至终浓 度为200μmol，MgCl₂为1.5mmol，上下游引物各0.2μmol，T aq酶1.5U（华美生物工程公司），总体积50μl。反应条件为94°C变性1mi n，54°C退火1min，72°C延伸2min，共进行30个循环，然后进行琼脂糖 凝胶电泳和酶切鉴定。

1.2.5PCR产物的克隆和序列分析：先用WizardPCR产物纯化试剂盒（ Promega，美国），按说明书要求对PCR产物进行纯化，再将PCR产物用Kle now酶（Promega，美国）补平；用BamHI酶切后，与pUC19-SmaI -BamHI连接，构成pUR3，按文献［6］的方法转化大肠杆菌DH5α，筛选重组子。将酶切鉴定过的重组子用Qiagen试剂盒（GmbH，德国）提取并纯化后，再用 373A自动序列测定系统（ABI，美国）进行荧光素标记测序。

2结果

2.1PCR扩增结果根据COLLINS等^［10］已发 表的从牛肠系膜淋巴结单核细胞中调取的FcγRⅢ的基因序列，本试验所设计的PC R引物 应该扩增到840bp左右的cDNA条带。但我们从牛肺巨噬细胞cDNA文库中仅扩增 到约600bp的特异性产物，无论增加或减少退火温度（从50°C到60°C）均出现 单一的600bp的cDNA条带，而从空质粒pCDM8中未能扩增到，说明该产物为特 异性产物。另外，在CDLLINS等报道的cDNA序列中，于第412位有1个Eco RI的酶切位点。当选用EcoRI酶切PCR产物时，却未能切开，表明在我们所获得的 的cDNA序列中，该位点已发生改变或已缺失。图1为PCR产物及重组质粒pUR3的鉴定。

图1重组质粒的酶切鉴定

Fig1 Identification of recombinants pUR3 and pSR3

The PCR product obtained from the cDNA library of bovine macrophages is sho wn in lane 1．The digested pUR3 and pSR3 with EcoRI and HindⅢ are respectively mi grated in lane 2 and lane 3．The marker φ x174 DNA-HaeⅢ is in lane 4．

2.2序列分析结果从序列分析结果可以发现，本试验所调取的基 因为590bp，其中阅读框架（ORF）仅为507bp，共编码168个氨基酸（终止 密码TAG除外，见图2）。经与Collins等克隆的boFcγRⅢ基因序列（简称 boFcγRⅢ-C）比较，在其编码基因的5’端和3’端序列中除有个别碱基变异外，绝 大部分的碱基是相同的，但在相当于boFcγRⅢ-C序列中的241位到486之间共 有246个碱基被缺失，即我们所克隆的boFcγRⅢ（简称boFcγRⅢ-Y）比b oFcγRⅢ-C缺失了82个氨基酸，见图3。

图2牛boFcγRⅢ-Y的cDNA序列及所推导的氨基酸序列

Fig.2 The nucleotiden sequence of boFcγRⅢ-Y and predicted amino acid sequence

The signal peptide sequence was underlined. The cysteine residues were double-underlined and the transmembrane region was underlined with wave line. The asparagine residues in parentheses indicated the potential N-linked gloycosylation sites. The stop codon was marked with asterisk.

图3牛boFcγRⅢ-C和boFcγRⅢ-Y的氨基酸序列比较

Fig.3 A comparison of deduced amino acid sequences between boFcγRⅢ-C and boFcγRⅢ-Y

Dashes indicate the deleted amino acids in boFcγRⅢ-Y. The signal pepeide sequences were inderlined. The transmembrane regions were underlined with wave lines and the cystenie tesidues in entrancelluar domains were shadowed. Dots under the residues denote the different amino acids between two swquences.

3讨论

研究表明^{［11～12］}，人和哺乳动物的FcγRⅢ是一类对IgG复合物具有低 亲和力的受体，它主要有自然杀伤性细胞（NK细胞）、粒细胞、T淋巴细胞和组织中的巨 噬细胞表达。根据它本身的结构特点及其<