摘要：目的探讨IL-6能否诱导M1小鼠急性髓样白血病细胞凋亡及其分子机制。方法透射电镜观察细胞形态判断有无凋亡发生；RT-PCR及狭缝杂交分析bcl-2家族成员表达水平的改变。结果IL-6诱导M1细胞向巨噬细胞方向分化后，M1细胞发生凋亡；bcl-2、bcl-X_L在IL-6诱导下表达下调，bax表达上调。结论IL-6诱导Bcl-2／Bax比例改变，使M1细胞分化后凋亡。

中图分类号：R392.11文献标识码：A

Apoptosis of M1 cells is induced by IL-6 after the cells undergo diffe-rentiation and its molecular mechanism

ZHANG Ji-yanSHEN Bei-fenWANG Jian-an

（Institute of Basic Medical Science，Academy of Military Medical Science，Beijing 100850，China)

ZHANG Xue-min

(National Center of Biomedical Analysis，Beijing 100850，China）

Abstract：Objective To investigate whether and how IL-6 can induce apoptosis of M1 myeloid leukemic cells．Methods We determined the role of IL-6 in apoptosis of M1 cells with transmission electron micrograph．We also detected the effect of IL-6 on the expression level of bcl-2 family．Results IL-6 could induce apoptosis of M1 cells after the cells underwent terminal differentiation．The molecular mechanism might be that IL-6 downregulated expression of bcl-2 and bcl-X_L，but up-regulated that of bax．Conclusion IL-6 makes the ration of Bcl-2／Bax change，which results in apoptosis of M1 cells．

Key words：IL-6；M1；apoptosis；Bcl-2／Bax▲

IL-6一贯被看作是凋亡抑制因子，它可抑制TGFβ1、某些细胞毒化合物、野生型P53诱导的急性髓系白血病细胞凋亡^［1］。在IL-6依赖株中，IL-6表现出更明确的抗凋亡效应——细胞在撤去IL-6后大量凋亡，其机制可能为JAK-STATs通路激活后诱导bcl-X_L表达；高水平表达外源bcl-2基因能抑制IL-6饥饿的B9骨髓瘤细胞凋亡^［2］。然而，由于IL-6生物学效应的多样性与双向性，细胞也可表现出不同甚至相反的效应。IL-3与IL-6联合预处理显著增强4-HC（4-hydroperoxycyclophosphamide）诱导的HL-60细胞凋亡，其机制可能为预处理增强了4-HC所致的HL-60细胞bcl-2、c-myc基因表达下调^［3］。与此一致的是，我们在以M1细胞为模型的研究中发现：10～100ng／mlrhIL-6处理4～5d后，M1细胞表现出明确的凋亡特征。由于M1细胞中野生型P53缺如，我们检测了rhIL-6处理前后bcl-2家族成员bcl-2、bax、bcl-X的表达情况，探讨M1细胞在rhIL-6处理后走向调亡的可能机制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞：M1细胞由本所王嘉玺教授惠赠，培养于10％FCS-1640中，每2～4d传代1次。

1.1.2试剂：rhIL-6（溶于含0.1BSA的PBS中）的比活性为10⁷U／mg，AMV逆转录酶、Taq酶、BCIP、NBT等购自Promega公司。

1.1.3探针及引物：含bcl-2、baxcDNA的质粒由本室保存。bcl-X引物^［4］序列如下：

P5：5’-GTGAGTGGACGGTCAGTG-3’

P3：5’-TTGGACAATGGACTGGTTGA-3’

1.2方法

1.2.1rhIL-6对M1细胞增殖影响的检测：将M1细胞调成5×10⁴／ml的密度，植入24孔板，每孔1ml，加0，1，10μg／mlrhIL-6各10μl（n＝2），37°C孵箱培养，每日计数。

1.2.2墨汁吞噬试验：将不同剂量rhIL-6处理0、1、2、3、4d的M1细胞用冰冷PBS洗2次后，调细胞密度为5×10⁵／ml，每0.1ml加入滤纸滤过的优质墨汁10μl。37°C温育30min或4h，洗去游离墨粒，甩片，Wright’s染色，油镜下计数胞浆中吞有大小墨粒5个以上的阳性细胞。

1.2.3DNA抽提：100ng／mlrhIL-6处理后，于不同时间（0、1、2、3、4d）各取M1细胞约10⁶，PBS洗2次后，移入1.5ml微量离心管中，离心去上清：加0.5ml裂解液（1g／L蛋白酶K；10mmol／LTris-C1，pH8.0；150mmol／LNaCl；10mmol／LEDTA；0．4％SDS）重悬细胞，50°C过夜，不时振摇。加等体积酚抽提几次后，乙醇沉淀。沉淀溶于100μlTE（pH8．0）中，加RNase至终浓度0.5g／L，37°C保温30min后，1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.4Wright’s染色及透射电镜观察细胞形态：按常规方法进行。

1.2.5RNA提取及RT-PCR：采用SDS／酚法提取细胞总RNA，OD₂₆₀／OD₂₈₀检测RNA完整性并定量。然后按下述方法进行RT-PCR，在0.5ml微量离心管中依次加入：2.5mmol／LdNTP2．0μl，5×RT缓冲液2.0μl，RNasin1U，随机引物100ng，RNA1.0μg，AMV2U，用DEPC水补足体积至10μl。混匀，室温10min，42°C60min，95°C5min，骤冷。分别取反转录产物1.0μl、3．0μl作为模板，在25μl体系中（含2.5μl10×PCR缓冲液，2.0μl2．5mmol／LdNTP，20μmol／LP5、P3各1.0μl，Taq酶1U）扩增GAPD和bcl-X。94°C1min、60°C1min、72°C1min，共35个循环，72°C延伸7min。最后取5μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

1.2.6探针制备及狭缝杂交：含有bcl-2、baxcDNA的质粒经PstI、BamHI双酶切鉴定正确后，回收345bp、222bp片段，按光敏生物素试剂盒说明书进行光敏生物素标记及狭缝杂交。

2结果

2.1rhIL-6对M1细胞生长、分化的影响rhIL-6明显抑制M1细胞增殖，使M1细胞饱和密度下降（见图1）。在生长停止的同时，M1细胞也恢复了终末分化，获得很强的墨汁吞噬能力，10～100ng／mlrhIL-6处理4d时，墨汁吞噬试验呈阳性的细胞达95％以上，且在30min内吞噬即达高峰，与4h无明显差异,表明M1向巨噬细胞方向分化（见图2）。

图1 rhIL-6对M1细胞生长的影响

Fig1 Effect of rhIL-6 on the growth of M1 cells

A：normal control；B：incubation with 10ng／ml rhIL-6；C：incubation with 100ng／ml rhIL-6

图2rhIL-6对M1细胞吞噬功能的影响

Fig2Effect of rhIL-6 on the phagocytic activity of M1 cells（Wright’s staining，×1000）

A：normal control；B：incubation with 100ng／ml rhIL-6 for 4d

2.2rhIL-6诱导M1细胞分化后凋亡M1向巨噬细胞分化后，在rhIL-6诱导下走向凋亡。100ng／mlrhIL-6处理4d后，M1细胞Wright’s染色可见类似凋亡小体的结构（见图3）。且细胞DNA呈典型的梯状ladder（见图4）。由于DNA梯状ladder不能作为区分坏死与凋亡的特征性标志，我们又取10ng／ml、100ng／ml处理4～5d的细胞做了透射电镜观察。电镜下可见10ng／ml、100ng／ml处理4～5d时，约有10％ 的细胞呈现凋亡各期的典型形态特征：染色质核膜下凝聚呈帽状、块状或月牙状，胞浆固缩，内质网扩张，胞浆空泡化——胞核及细胞外形皱缩，核裂解成质膜包绕的团块，即凋亡小体，电镜下凋亡小体的存在是确认凋亡发生最可靠的依据。对照组则没有上述特征的细胞，说明凋亡确由rhIL-6诱导产生。

图3100ng／ml rhIL-6作用前后M1细胞的形态变化

Fig3Morphological changes of M1 cells induced by 100ng／ml rhIL-6

A，C：normal control；B，D，E，F：incubation with rhIL-6 for 4d；A，B：wright’s staining（×1000）；C，D，E，F：trans-mission electron micrograph

图4100ng／ml rhIL-6作用前后M1细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳

Fig41.5％ agarose gel electrophoresis of DNA samples from M1 cells treated with or without 100ng／ml rhIL-6

2.3凋亡的可能机制为Bcl-2／Bax比例下降为探讨M1细胞分化后凋亡的可能机制,我们以bcl-2、baxcDNA为探针，检测了10ng／mlrhIL-6处理不同时间bcl-2、baxmRNA表达水平的改变。首先用PstI、BamH1双酶切鉴定了含bcl-2与baxcDNA的质粒，分别切出了345bp与222bp的片段，与预测