摘要：目的 研究T细胞受体（TCR）Vβ在外周血淋巴细胞（PBLs）中的表达。方法 用单克隆抗体CD28＋B7．1（CD80）共刺激正常人外周血淋巴细胞后作用于肝癌细胞（BEL-7402）。结果 发现PBLs TCR Vβ7基因在体外选择性扩增，表达水平为15％～25％，对照组为4％～8％。结论 Vβ7基因对识别肿瘤抗原具有特异性，为肿瘤基因治疗和研究提供新的线索和实验依据。

中图分类号：R392.11文献标识码：A

Selective expression of TCR Vβ gene in PBLs costimulated by

CD28＋B7．1 and induced by hepatoma cell

YANG HongHUANG Shu-lin

（Department of Molecular Biology， Guangdong Pharmacy College， Guangzhou 510224，China)

LI JING-hua

(Department of microbiology，Bethune University of Medical Sciences，Changchun 130021，China）

Abstract：Objective To investigate selective expression of T cell receptor（TCR） Vβ gene in peripheral blood lymphocytes（PBLs）．Methods The healthy human PBLs were costimulated by anti-CD28 and anti-CD80（B7．1） McAb and induced by hepatoma cells（BEL-7402）．Results TCR Vβ7 gene were selectively amplified in PBLs induced by BEL-7402 cells and the expression level of Vβ7 was much higher in these cells than in controls （15％～25％ vs 4％～8％）．Conclusion Vβ7 gene may specialize in recognizing tumor antigen． Our study offers new clues and experimental basis for gene treatment of tumor．

Key words：TCR Vβ gene； CD28＋B7．1（CD80）；gene expression▲

TCR是参与特异性免疫的重要分子，在T淋巴细胞活化过程中识别和结合配体。研究发现正常个体在抗原刺激下，外周血淋巴细胞（PBLs）TCR Vβ基因随抗原类型不同或疾病的不同临床阶段呈选择性扩增^［1］。大量实验证实，抗原（Ag）与TCR的结合仅仅是免疫应答的开始，只有当抗原递呈细胞（APC）表达B7分子，作用于T细胞表面的CD28受体作为第二刺激信号，T细胞才被激活，分裂增殖。在生理状态下，未经刺激的APC表面不表达B7.1分子或表达水平极低不能引起有效的抗肿瘤免疫应答，CD28与B7.1的相互作用提供了T细胞活化所必需的主要共刺激信号^［2］。为更好地增强APC呈递能力和提供充足的共刺激信号，本研究用CD28＋B7．1（CD80）共激活PBLs后作用肝癌细胞（BEL-7402），研究探讨PBLs TCR Vβ亚家族基因的选择性表达特征。

1材料与方法

1.1试剂及仪器

抗CD28、CD80单克隆抗体（McAb）冻干粉购自Immunotech公司；Taq DNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNAsin、dNTPs、DTT购自Promaga公司，DEPC、RPMI1640购自Sigma公司；其他试剂为国产AR试剂。基因扩增仪GeneE（英国），CO₂培养箱BNA-311（日本），凝胶成象扫描仪Gel Doc-1000（Bio-Rad）。

1.2方法

1.2.1淋巴细胞培养：健康成年人全血购自市中心血站。100ml血用Ficoll密度梯度离心分离单核细胞，用RPMI 1640培养（含10％灭活小牛血清），每管10ml，分别加入维持量IL-2（20u／ml）、CD28＋CD80（各为0．4μg／ml），在37°C、5％CO₂孵箱中培养3d。

1.2.2肝癌细胞（BEL-7402）培养：肝癌细胞系（BEL-7402）由中山医科大学肿瘤所赠。用0.25％胰蛋白酶消化，加2ml 1640液吹散细胞，再加入含10％小牛血清的1640液，共10ml。在37°C、5％CO₂孵箱中培养，直至形成单层细胞，倾出培养液，加入抗体诱导的淋巴细胞培养1d，对照组不作用肝癌细胞，收获细胞，－70°C保存备用。

1.2.3RNA提取： RNA提取参见CHOMCZY-NSKI方法^［3］。

1.2.4引物设计： 参见文献［4，5］，序列见文献［12］。

1.2.5cDNA合成、RT-PCR检测TCR Vβ基因：参见文献［6］。

1.2.6探针标记、Southern杂交、化学发光与X光片显影等（Lumi-phos530）：见文献［7］。

1.2.7图象分析^［5］：Southern杂交后的X-胶片用凝胶成象扫描仪进行处理，TCR Vβ所形成的一条密度带被转化为数字，用NIH-图象分析软件（1.57版本）在计算机上进行处理，用公式：（Vβ的密度）×100／（Vβ1-22）的累积密度，计算TCR Vβ的相关频率^［8］。

2结果

2.1TCR Vβ基因Southern杂交图1是CD28＋CD80协同刺激健康人PBLs（对照组）及受肝癌细胞BEL-7402诱导（实验组）后TCR Vβ基因PCR产物Southern杂交印迹图。由图可见，在肝癌抗原刺激下，PBLs中TCR Vβ7亚家族基因片段呈选择性优势扩增（见箭头所示）。

图1PBLs TCR Vβ基因PCR产物Southern杂交图谱

Fig1Southern hybridization map of PBLs TCR Vβ gene PCR product

A（control）：Southern hybridization map of TCR Vβ gene PCR product costimulated by CD28＋CD80

B（treatment）：Southern hybridization map TCR Vβ gene PCR product costimulated by CD28＋CD80， and induced by hepatoma cells

2.2TCR Vβ基因表达水平检测图2是CD28＋CD80协同刺激健康人PBLs（对照组）及受肝癌细胞BEL-7402诱导（实验组）后，PBLs TCR Vβ基因表达水平检测。光密度扫描结果显示，在肝癌抗原刺激下，Vβ7亚家族基因表达显著升高，表达水平为24.41％。

图2PBLs TCR Vβ基因亚家族表达水平（％）

Fig2The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs （％）

Control： The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs costimulated by CD28＋CD80

Treatment：The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs costimulated by CD28＋CD80 and induced by hepatoma cells

3讨论

TCR是T淋巴细胞接受抗原刺激产生特异性免疫应答的受体，多数T细胞的TCR由α、β链构成，人体TCR β链V基因有25个片段供挑选组成TCR受体库。在没有抗原刺激时，TCR Vβ基因的表达完全是随机的^［9］。目前的研究热点在TCR V区基因对抗原的识别机制和特异性表达上，特别是TCR Vβ基因亚家族的使用频率和选择性扩增。有报道，IL-2作用下人TIL的TCR Vβ5、6、8基因呈优势扩增^［1］，SIV感染恒河猴淋巴细胞，Vβ7、14基因呈高表达^［10］。本室用HSV-2感染健康人PBLs时TCR Vβ2、6、7、8基因表达频率增高，而生殖器单纯疱疹性皮肤病人发作期、中间静止期和再发作期的PBLs用HSV感染时，TCR Vβ基因的表达却不同。这提示在疾病不同发病阶段外周血T细胞识别抗原时，Vβ基因亚家族呈不同的优势扩增^［11］。T细胞被激活时除其表面抗原特异性受体感受抗原多肽的刺激之外，另一些受体也必须感受并传递一个附加刺激的受体即CD28，CD28传递的信息可防止T细胞特异性抗原诱发的耐受，同时可以使激活的T细胞内各种细胞因子mRNA（如IL-2mRNA）的稳定性增加。B7.1可使APC表面B7.1分子表达增多，CD28与B7.1的相互作用产生的共刺激信号加强抗原呈递能力，是T细胞应答产生CTL的诱导相中所必需的，是典型的共刺激途径。本文用CD28＋B7．1（CD80）协同刺激健康人PBLs后作用于肝癌细胞，结果显示PBLs TCR Vβ7表达水平明显增高，而其它Vβ亚家族基因的表达水平无明显改变，但有个体差异,说明PBLs TCR在接受抗原刺激过程中，Vβ7特异性识别肿瘤抗原而呈优势扩增，且表达水平稳定，为我们下一步研究工作——肿瘤的基因治疗提供特异性片段。■

基金项目：国家自然科学基金（396400005）和广东省科教兴医“五个一”工程重点课题（粤卫科［1996］20号）资助项目

作者简介：杨 红（1965-），女，广东人，讲师，本科，主要从事分子免疫学方面的研究。

参考文献：

［1］傅体辉．T细胞识别肿瘤的分子机制［J］．国外医学免疫学分册，1995，1：23～26．

［2］黄树林，罗利琼，肖兰凤，等．McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡［J］．中国免疫学杂志，1998，14（2）：154～156．

［3］CHOMCZYNSKIS P<