中图号 R329．25；R589．2

EFFECTS OF CHOLESTEROL DEFICIENCY ON THE

EXPRESSION OF CELL CYCLE REGULATORY

PROTEINS IN JURKAT CELLS

Zhou Dongming， Mi Mantian， Xu Hongxia， Lang Haibin， Zhang Qianyong

（Department of Nutrition and Food Hygiene， Third Military Medical University， Chongqing 400038）

Abstract In this report， the molecular mechanism of cholesterol deficiency affecting proliferation of T lymphocytes was studied from the angle of cell cycle control． The results showed that the DNA synthesis capacity was decreased and the expression of cyclin D1，CDK4 and rRb proteins， which are the key regulators of G₁→S phase transition， was down-regulated in Jurkat cells after treated with lovastatin for 3 days． When supplied with LDL， the cellular proliferation and the expression of these cell cycle regulatory proteins were partly increased． These results suggest that the down-regulation of cyclin D1， CDK4 and pRb proteins may be related to the effects of cholesterol deficiency on proliferation of Jurkat cells．

Key words Cholesterol， Lovastatin， Cell cycle regulatory protein， Jurkat cells

近年来对细胞周期调控分子机制的研究已有突破性进展，使人们认识到细胞周期进程依赖于不同的cyclin／CDK复合物在恰当时间形成、激活及灭活^［1］，其中cyclin是调节亚基，CDK是催化亚基。有研究显示，cyclin D1／CDK4及cyclin E／CDK2是其中最重要的两对复合物，它们在G₁→S期转化中发挥重要作用^［2］，而pRb蛋白则被认为是调节细胞增殖与分化的开关，在调节细胞增殖与分化过程中具有重要作用^［3］。胆固醇（Cholesterol， ch）作为哺乳动物细胞膜上的主要成分，对细胞的生长增殖及膜的生物物理特性等都有非常重要的作用。用lovastatin抑制细胞内源性胆固醇的合成，可使细胞增殖受抑，并将细胞阻滞于G₀／G₁期，而不能进入S期^［4，5］，用低密度脂蛋白受体（LDL-R）介导的LDL内吞可部分降低这种抑制作用，其分子机制尚不十分清楚。为了探讨细胞胆固醇缺乏阻遏细胞增殖的分子机制,我们研究了胆固醇自稳失调对T淋巴细胞中cyclin D1、CDK4及pRb蛋白表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株的培养 Jurkat T淋巴细胞株由本校免疫学研究所提供。细胞分别在含10％热灭活小牛血清或含10％去脂血清（AES）的RPMI1640培养液中常规培养传代。

1.2 去脂血清的制备 参照Corwin等^［6］方法，在－20°C条件下，将小牛血清：丙酮（1∶9）混合去脂，过滤后将沉淀于真空干燥器内干燥过夜，干粉末用Hanks平衡液溶解，离心去沉淀，取上清过滤除菌即获得AES。

1.3 LDL及lovastatin处理 lovastatin（Merk公司产品）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配成20mg／ml储备液，贮存于－20°C，处理细胞时终浓度为0．5μg／ml，LDL（Sigma产品）用去脂血清培养基配成1mg／ml储备液，处理细胞终浓度为10 μg／ml（相当于10.7 μg胆固醇）。

1.4 实验分组 ①正常血清组，②去脂血清＋LDL组，③去脂血清组，④去脂血清＋lovastatin＋LDL组，⑤去脂血清＋lovastatin组。

1.5 抗体 兔抗p34^CDK4F、鼠抗cyclin D1及pRb单克隆抗体均为Santa Cruz生物工程公司产品，SP试剂盒为Zymed公司产品，PVDF膜为美国杜邦公司产品。

1.6 ³H-TdR掺入实验 细胞经正常血清、去脂血清、去脂血清加lovastatin和（或）LDL培养72h，于收获细胞前6h加入³H-TdR（0．5 μCi／孔），常规收获细胞，测cpm值。

1.7 免疫细胞化学染色 经不同因素处理3d后的各组细胞，涂片，4％多聚甲醛固定，0．3％ H₂O₂甲醇溶液封闭，10％山羊血清孵育，加一抗4°C孵育过夜（用0.01MPBS代替一抗进行阴性对照实验），再与生物素标记的二抗及链霉素亲生物素-过氧化物酶反应，用含0．05％DAB＋0．03％CoCl₂＋0．03％H₂O₂的0．01mol／L Tris-Cl（pH7．4）缓冲液显色。

1.8 免疫印迹分析 细胞经不同因素处理72 h后收获细胞，1×10⁷个细胞经100 μl 1％ NP-50裂解液（含50 mmol／L tris，150 mmol／L NaCl，1％ NP40，25mmol／L NaF， 5mmol／L Na₃VO₄，5mmol／L Na₂P₂O₇，0．1％SDS， 1mmol／L PMSF， 10 μg／ml Leupetin， 10μg／ml Aprotinin）裂解，25 μl样品中加25 μ1 2×SDS加样缓冲液，沸水中煮5 min，经10％ SDS-PAGE电泳后用电转移转膜，1％ BSA37°C封闭1h或4°C过夜，加一抗37°C孵育分别1h，再用二抗及SP-HRP37°C孵育1 h，用含0．05％ DAB＋0.03％CoCl₂＋0．03％H₂O₂的0．01mol／L Tris-Cl（pH7．4）缓冲液显色。

2 结果

2.1 胆固醇缺乏对T淋巴细胞增殖功能的影响 图1显示，细胞经AES培养基加不同因素处理3d后，可使细胞DNA的合成受到不同程度的抑制,不论是内源性还是外源性胆固醇的缺乏，都可使T淋巴细胞DNA合成受到明显抑制,³H-TdR掺入量下降，各处理组与对照组比较有显著差异（P＜0.01），其中AES＋lovastatin组的DNA合成受到的抑制最为明显。若加入一定剂量（10μg／ml）LDL则可部分恢复DNA的合成作用，与AES＋lovastatin组比较相差非常显著（P＜0．01）

图 1细胞胆固醇缺乏对Jurkat T淋巴细胞³H-TdR掺入的影响

Fig 1Effect of cholesterol deficiency on the ³ H-TdR

incorporation rate in Jurkat cells

2.2 细胞胆固醇改变对cyclin D1、CDK4蛋白表达的影响 免疫细胞化学染色发现在T淋巴细胞中，cyclin D1蛋白阳性反应物主要集中在细胞核，而CDK4蛋白则弥漫于整个细胞，细胞核中阳性着色略强于细胞质。细胞经去脂血清培养基加不同因素处理72h时后，cyclin D1蛋白阳性反应物有不同程度的降低，其中以AES＋lovastatin组的降低程度最为显著，若同时补充10 μg／ml的LDL以补充外源性胆固醇，则可部分抑制这种降低作用，见图2、3、4，CDK4蛋白阳性反应物强度也有类似变化。

图 2未处理的正常细胞cyclin D1蛋白强阳性（×400）

Fig 2Immunocytochemical staining of cyclin D1 protein in untreated lymphocytes， showing intensive positivity （×400）

图 3细胞经AES＋lovastatin培养3d后cyclin D1蛋白弱阳性（×400）

Fig 3Immunocytochemical staining of cyclin D1 protein in lymphocytes treated with AES＋lovastatin for 3d， showing weak positivity（×400）

图 4细胞经AES＋lovastatin＋LDL培养3d后cyclin D1蛋白中等强度阳性（×400）

Fig 4Immunocytochemical staining of cyclin D1 protein in lymphocytes treated with AES＋lovastatin＋LDL for 3d， showing moderate positivity（×400）

2.3 细胞胆固醇改变对pRb蛋白表达的影响 免疫印迹分析表明，去脂血清培养基培养的细胞加lovastatin处理3d后，pRb蛋白表达量明显降低，而单用去脂血清或lovastatin处理的同时加10 μg／ml LDL培养细胞3d后，pRb蛋白表达的下降没有AES＋lovastatin组明显，见图5。用免疫细胞化学染色法也可得到类似结果。

图 5细胞胆固醇缺乏对pRb蛋白表达的影响

Fig 5The effects of cholesterol deficiency on the expression of pRb protein

A：control group；B：AES＋LDL group；C：AES group；

D：AES＋lovastatin＋LDL group；E：AES＋lovastatin group

3 讨论

哺乳动物细胞中细胞周期调控的核心机制是通过不同cyclin与其相关的CDK形成复合体，产生特定的激酶活性，使细胞通过特定的调控点顺利地完成细胞周期。细胞周期的进程有赖于不同cyclin／CDK复合物在恰当时间形成，被活化以及灭活^［1］，其中cyclin是调节亚基，CDK是催化亚基。有研究表明，cyclin E／CDK2和cyclin D1／CDK4复合物在细胞的G₁→S期转换过程<