摘 要 采用Jurkat细胞免疫Balb／c小鼠制备了1株抗人Fas mAb 2A1，它能特异性识别Jurkat、Raji、THP-1细胞膜表面50KD左右的蛋白，并能与SrFas标准蛋白反应，其识别的细胞膜蛋白与单抗特异性抗人Fas PcAb N-18相一致。经Ig类与亚类及型检测试剂盒测定为IgG1、κ型，杂交瘤细胞染色体数目平均为102。

中图号 R392.11

PRODUCTION AND IDENTIFICATION OF A MONOCLONAL ANTIBODY TO HUMAN FAS ANTIGEN

Song Jianxun， Zhu Xihua， Chen Kemin， Zheng Ping

（Department of Immunology， The Third Military Medical University， Chongqing 400038）

Abstract A mAb against human Fas（huFas）， designated 2A1， was produced by fusion of the mouse myeloma cell line Sp2／0 with the spleen cells of Balb／c mice immunized with Jurkat cells． Using Dot-ELISA and western blotting and functional experiments， its was evidenced that anti-huFas mAb 2A1 is specifically directed to huFas and can recognize the Fas protein of about 50KD on Jurkat cells， Raji cells and THP-1 cells． Analysis of Ig classes subclasses and types revealed 2A1 to be IgG1， κ．

Key words Fas antigen， Monoclonal antibody（mAb）， Production， Identification

Fas／Apo-1／CD95抗原的发现起始于对两株mAb的功能观察，即抗Apo-1 mAb和抗Fas mAb^［1，2］， 由于两者都能识别细胞膜上CD95蛋白抗原，且能诱导敏感细胞凋亡，才导致了今天对Fas抗原的生物医学研究。制备抗Fas mAb对于Fas抗原的深入研究，尤其是对Fas抗原信号传导机制的阐明以及生物医学应用都有重要意义。本文利用Fas^＋的细胞作为免疫原，功能检测制备了1株鼠抗人Fas mAb 2A1。

1 材料和方法

1.1 培养液

1.1.1 完全培养液：含10％～20％无支原体新生小牛血清（NCS，华西医大分子生物室，批号970502），2mmol L-Gln， 20mmol Hepes， 100U／ml青霉素和100μg／ml链霉素的RPMI1640（Gbco）。

1.1.2 不完全培养液：不含NCS的完全培养液。HT培养液：完全培养液中加入1×10^－4M次黄嘌呤（H）和1．6×10^－5M胸腺嘧啶（T）。HAT培养液：HT培养液中加入4×10^－7M氨基喋呤（A）。

1.2 细胞系 Sp2／0小鼠骨髓瘤细胞、Jurkat人T淋巴细胞性白血病细胞、Raji人Burkitt（非洲）淋巴瘤细胞、U937人组织细胞性淋巴瘤细胞为本室保存。THP-1人单核白血病细胞引自中科院上海细胞生物所。各细胞系于含10％ NCS的RPMI1640完全培养液中培养传代。

1.3 抗体 单特异性兔抗人Fas多克隆抗体（PcAb）N-18购自Santa Cruz公司。鼠抗人Fas mAb CH-11：Kamiya公司，我室访美学者郑力新赠送。HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗鼠IgG：购自华美公司。

1.4 动物 Balb／c雌性纯系小鼠，6～8wk，由本校实验动物中心提供。

1.5 其它主要试剂 鼠Ig类与亚类及型检测试剂盒：IsoStrip^TM kit购自BM公司。硝酸纤维薄膜（NC膜）：为Gibco公司产品。可溶性重组人Fas胞外区蛋白（SrFas△TM）购自PharMingen公司。融合用试剂：50％融合用聚乙二醇／PEG（Sigma， MW4 000，含10％二甲亚砜／DMSO），亮氨酸甲基酯／Leu-OMe（Sigma，MW181．7），A、H、T（Sigma），8-氮杂鸟嘌呤（Fluka），秋水仙素（Serva）。膜蛋白提取试剂：抑蛋白酶肽Aprotinin （BM），润湿剂NP-40（Fluka），苯甲基酰磺酰氟／PMSF（BM），脱氧胆酸钠（Serva），十二烷基硫酸钠／SDS和低MW蛋白标准（华美）。

1.6 抗人Fas mAb的产生 ①动物免疫：基础免疫为Balb／c小鼠腹腔注射Jurkat细胞免疫原0.2ml，含2×10⁷细胞／鼠，免疫2次，间隔2～4wk。加强免疫为脾内加强免疫。每脾注射0．1ml细胞免疫原，含1×10⁶细胞／脾。3d后融合。②细胞融合、筛选及克隆化：小鼠脾细胞先用2．5mmol Leu-OMe处理，再与Sp2／0按10∶1的比例以50％ PEG进行融合^［3］。融合细胞用HAT培养液选择培养，杂交瘤生长后改用HT培养液，融合后10d～15d取上清进行筛选。杂交瘤上清对Jurkat细胞生长有毒性作用的孔初步定为阳性孔。克隆及亚克隆化采用有限稀释法。③腹水制备及抗体纯化：阳性杂交瘤细胞10⁵腹腔注射石蜡油已致敏的Balb／c小鼠制备腹水，饱和（NH₄）₂SO₄盐析和DEAE纤维素层析相结合纯化抗体。

1.7 抗人Fas mAb 2A₁的鉴定 ①Dot-ELISA：SrFas抗原标准品点样于NC膜上，1％ BSA封闭后，相继用杂交瘤腹水和HRP-羊抗鼠IgG作用，DAB显色，抗人Fas mAb CH-11作为阳性对照。②Western Blotting：Fas^＋敏感细胞用PBS洗涤后，用三去污剂裂解液（50mol／L Tris-Cl， pH8．0， 150mmol／L NaCl， 0．02％ NaN₃， 0．1％ SDS， 100mg／L PMSF， 1μg／ml Aprotinin， 1％ NP-40，0．5％脱氧胆酸钠）抽提膜蛋白^［4］，经12％ SDS-PAGE分离，转移至NC膜后，相继用杂交瘤腹水和HRP-羊抗鼠IgG作用，DAB显色。③杂交瘤细胞染色体分析：参照文献［5］，即秋水仙素作用获取杂交瘤细胞染色体中期分裂相，KC1低渗处理细胞，Giemsa染色。④Ig类与亚类及型鉴定：按Boehringer Mannheim公司生产的IsoStrip^TM试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞系的建立 用Jurkat细胞作为免疫原制备杂交瘤，分批免疫Balb／c小鼠，共72只，前后进行了8次成功融合，平均融合率约80％。从3072个杂交瘤生长孔上清中，筛选出对Jurkat细胞生长有抑制／毒性作用的孔3个，经克隆及反复亚克隆化后，分别命名为2A1，3B6，3D1。制备上清和小鼠腹水。

2.2 Dot-ELISA 经复孔试验，对杂交瘤细胞系2A1，3B6，3D1小鼠腹水测试发现：仅2A1能与SrFas蛋白反应，斑点阳性对照抗Fas mAb CH-11亦能与SrFas结合并显色，SP2／0腹水则显示阴性结果（见图1）。

图 1斑点酶联免疫吸附试验

Fig 1Dot-ELISA

1．2A1； 2．3B6； 3．3D1； 4．anti-Fas mAb CH-11；5．SP2／0

2．3 免疫印迹 Jurkat细胞、Raji细胞、THP-1细胞膜蛋白提取样品经SDS-PAGE后，用考马斯亮兰R-250染色液（0．25％考马斯亮兰R-250，25％异丙醇，10％冰乙酸）染色及脱色后，显示蛋白条带相似，与U937细胞膜蛋白条带差异明显（见图2）。经电转印及免疫染色后发现，杂交瘤腹水2A1能与Jurkat细胞、Raji细胞、THP-1细胞膜蛋白上50KD左右蛋白带反应，与特异性兔抗人Fas PcAb N-18所识别的位置一致（见图3），但在U937细胞膜蛋白带上未能检测阳性结果。

2．4 杂交瘤细胞染色体分析 染色体数目平均为102，见图4。

2．5 Ig类与亚类及型鉴定 从BM公司试剂盒检测条带上显示，杂交瘤2A1分泌的抗体为IgG1，κ型。体外传代3mo及液氮反复冻融，细胞株仍能分泌抗体。

图 2细胞膜蛋白的SDS-PAGE

Fig 2SDS-PAGE of membrane fractions

A：1．U937l；2．Jurkat；3．Molecular weight standard； 4．Raji； 5．THP-1

B：Jurkat and molecular weight standard

图 3免疫印迹

Fig 3Immunobloting analysis of Fas antigen

1．Molecular weight standard； 2．Anti-Fas PcAb N-18； 3.2A1；4．2A1 to SrFas； 5．Supernatant of SP2／0

图 4杂交瘤细胞染色体（吉氏染色，1 000×）

Fig 4The chromosomal morphology of hybridoma

cells （Giemsa’s stain， 1 000×）

3 讨论

3.1 Fas抗原的发现 Fas抗原是两个研究组于1989年同一年在各自的实验室发现的。一组是德国学者Trauth^［1］所在的研究组为了抑制肿瘤的生长，采用细胞表面分子来控制其增殖；用鼠抗人B淋巴细胞系SKW6.4的单抗，来检测这些单抗对SKW6.4细胞生长的影响，在几千个抗体的实验中，发现抗Apo-1单抗能彻底抑制SKW6.4细胞的生长，并诱导植入裸鼠体内的人B细胞淋巴瘤组织消退。因为Apo-1抗原介导的信号能诱导细胞凋亡——Apoptosis，所以抗Apo-1单抗作用的细胞表面分子叫Apo-1抗原。另一组是日本学者Yonehara^<