摘 要 应用RT-PCR方法，从U937细胞总RNA中扩增得到编码人CD46分子跨膜区和膜内区cDNA片段，用PCR方法扩增得到编码成熟的CD59胞外区蛋白的cDNA片段，连接并构建了跨膜型的CD59分子cDNA。快速克隆于pGEM-T Easy载体进行序列测定，证实了其阅读框的完整和序列的正确性。进一步将cDNA重组于逆转录病毒pLXSN载体，电穿孔转染PA317细胞，用病毒上清感染小鼠NIH3T3、EL-4细胞，经FACS检测筛选获得表达重组CD59TM分子的阳性细胞克隆。本研究为更深入地研究GPI锚固的CD59分子与细胞活化信号转导的关系建立了可靠的细胞模型；同时也为探讨应用跨膜型的CD59分子对PNH进行基因治疗奠定了良好的基础。

中图号 R392.12

RECOMBINATION AND EXPRESSION OF TRANSMEMBRANE FORM OF HUMAN CD59 ON MOUSE NIH3T3 AND EL-4 CELLS

Bai Yun，Jiang Man，Hang Gencheng，Wang Gengyin，Zhu Xihua

（Department of Immunology，The Third Military Medical University，Chongqing 400038）

Abstract In this paper，the transmembrane form of CD59（CD59-TM） cDNA was constructed by linking the extracellular portion of CD59 to the transmembrane and cytoplasmic domains of MCP，which was amplified by RT-PCR method from total RAN of U937 cells．The fused cDNA fragement was cloned into pGEM-Easy plasmids and sequenced．The recombinant CD59-TM cDAN was further subcloned into retroviral vector pLXSN and after transfected into packaging cell line PA317，mouse fibroblasts and thymotase cell line EL-4 were infected with the virus resulting in stable expression of CD59-TM on the cell surface．The success of construction and expression of CD59-TM molecule on NIH3T3 and EL-4 cells provides a useful model to study the significance of the GPI anchor in si-gnal transduction，and also pave a way for retroviral gene therapy for PNH patients．

Key words CD59，Transmembrane form，Complement，Gene expression

CD59分子是补体系统终末阶段的调节蛋白，它以同源限制的方式抑制攻膜复合物C5b-9的生成，保护自身正常组织细胞免受补体损伤^［1，2］。CD59的异常和缺损可导致红细胞对自身补体的敏感性增加，是引起夜间阵发性血红蛋白尿（PNH）的直接原因^［3，4］。在天然状态下，CD59通过肌醇磷脂酰聚糖（GPI）锚固于细胞膜，广泛分布于各组织细胞表面，GPI锚结构的缺失或异常也可导致CD59表达的缺失。目前的研究表明，大多数PNH是由于与合成GPI糖脂链核心部分有关的PIG-A类基因突变，导致GPI锚合成障碍所致。在这种情况下，显然不能通过导入天然的GPI-锚固型的CD59基因来对PNH实行基因治疗，而导入并表达有功能的跨膜型CD59分子可为其基因治疗提供一条可尝试的途径。此外，GPI锚固的CD59是一个重要的信号转导分子，参与了单核细胞、粒细胞、血小板、T细胞的活化信号转导过程，尤其是在T细胞活化中的辅助刺激作用倍受人们的关注^［5～7］。GPI锚在信号转导中的作用也是急待阐明的问题之一。本室在以前的研究中，已经获得了CD59的全部编码cDNA序列，并成功地构建了表达GPI锚固型CD59分子的小鼠NIH3T3、EL-4细胞模型^［8，9］。本研究的目的在于构建跨膜型的CD59分子cDNA，并将其表达于小鼠NIH3T3和EL-4细胞。一方面为更深入地研究GPI锚固的CD59分子与细胞活化信号转导的关系提供可靠的细胞模型；同时也为探讨应用跨膜型的CD59分子对PNH进行基因治疗奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 质粒载体pGEM-T Easy购自Promega公司；逆转录病毒载体pLXSN为本室保存；Titan^TM One Tube RT-PCR试剂盒购自BOEHRINGER MANNHEIM公司；限制性内切酶、T4连接酶购自华美公司；anti-CD59单抗2A7由本室制备。G418购自Promega公司；U937、PA317、NIH3T3和EL-4细胞系由本室保存。

1.2 引物设计和合成 设计合成2对引物，引物1和2用于扩增编码CD59的胞外区1-77aa的cDNA序列，其3’-端加上一个Ssp Ⅰ酶切位点。引物3和4用于扩增编码CD46的跨膜区及膜内区270～350aa部分的cDNA序列，5’-端引物利用了其自身的Stu Ⅰ位点，而在3’-端引物中引入一个Xba Ⅰ位点。PCR引物由上海细胞研究所合成。

Primer1： 5-GAATTCATGGGAATCCAAGGAGG-3

Primer2： 5-CGCGAATATTTTCAAGCTGTTCG-3

Primer3： 5-CGCGAGGCCTACTTACAAGCCTCCAG-3

Primer4： 5-CGTCTAGACTATTCAGCCTCTCTGCTCTGC-3

1.3 细胞总RNA的提取 采用CD46高表达的U937细胞系，参照异硫氰酸胍一步法^［10］提取总RNA，提取物于1.5％的琼脂糖凝胶上行甲醛变性电泳。

1.4 RT-PCR扩增CD46-TM cDNA片段 参照Titan^TM One Tube RT-PCR System说明书并加以改进。以U937细胞总RAN为模板，用引物3和4进行RT-PCR扩增，取8μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳观察结果。扩增片段以EcoR V酶切鉴定。

1.5 PCR扩增CD59胞外区cDNA片段 以完整的CD59 cDNA为模板，用引物1和2扩增CD59信号肽及1-77aa编码序列，扩增片段以Pst Ⅰ酶切进行初步鉴定。

1.6 CD59-TM cDNA的连接 将上述PCR产物纯化回收，分别用Ssp Ⅰ和Stu Ⅰ酶切，纯化回收后用T4连接酶连接，然后再用引物1和4进行PCR扩增，PCR反应程序为94°C变性60s；55°C退火60s；72°C延伸90s，周期为30个循环，最后72°C延伸10min。取8μl PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳观察结果，分离纯化560bp片段。该扩增片段以Pst Ⅰ和EcoR Ⅴ酶切进行初步鉴定。

1.7 基因克隆和序列分析 将上述PCR产物与pGEM-T载体连接，转化入E．coli JM109后经氨苄青霉素及α-互补筛选，用EcoR Ⅰ酶切鉴定，得到含有560bp插入片段的重组质料。DNA序列分析由上海公司进行自动测序操作。

1.8 重组表达质粒pL-MCP的构建 按图4的方案进行，DNA重组技术如DNA片段的回收、酶切、连接、转化等均参照文献^［11］方法。

1.9 基因转染 按文献^［11］的方法，用电穿孔法将pL-MCP质粒导入PA317细胞，同时导入pLXSN空载体对照；G418加压筛选重组细胞克隆，收集病毒上清，感染NIH3T3细胞和EL-4细胞，加G418筛选重组细胞克隆。

1.10 FACS检测重组细胞CD59-TM的表达 随机挑选pL-MCP感染的NIH3T3细胞和EL-4细胞，调整为1×10⁵／ml，用anti-CD59 mAb 2A7进行免疫荧光染色。用FACScan进行流式细胞分析。

2 结果

2.1 CD46-TM片段和CD59胞外区cDNA的扩增 CD46广泛分布于人体各组织细胞表面，但在不同的组织细胞的表达有所差异。我们选择高表达的U937细胞为原材料抽提总RNA，电泳结果显示不同批次抽提的RNA28S、18S、5S三带明显，且28S＞18S。紫外测定表明A260／A280＞1.8，说明抽提的总RNA完整，且纯度符合反转录要求。本实验按说明书方法，以反义引物3和4进行RT-PCR，扩增所得的产物较少，有非特异性产物存在，结果不理想。后经多次改进，最终获得258bp的单一片段。以CD59的完整的cDNA为模板，PCR扩增CD59胞外区cDNA获得314bp的片段（见图1）。

图 1RT-PCR及PCR产物电泳图谱

Fig 1Electrophoresis for RT-PCR and PCR produc-

tion on 1．5％ agarose gel

Line 1：DNA markers

Line 2：RT-PCR production of CD46-TM

Line 3：PCR production of CD59（-25～77aa）

2．2 CD59-TM cDNA的连接及克隆 上述PCR产物分别用SspⅠ和Stu Ⅰ酶切后用T4连接酶连接，然后再用引物1和4进行PCR扩增，分离产物中的572bp大小的片段。该扩增片段以SspⅠ和Stu Ⅰ酶切证实上述酶切位点消失，用Pst Ⅰ酶切可切除约75bp的编码CD59信号肽的片段，初步证实所扩增的片段可能是重组CD59-TM的cDNA片段。进一步将扩增的cDNA片段与质粒pGEM-T Easy连接，经氨苄青霉素抗性及α-互补筛选后，用EcoR Ⅰ酶切鉴定，阳性重组子可切出572bp的片段（见图2），说明cDNA已克隆于载体中，命名为pGEM-CD59TM。

图 2重组CD59-TM cDNA的酶切鉴定图谱

Fig 2Restriction map of recombinant CD59-TM cDNA

Lane1：λ DNA／HindⅢ Markers

Lane2：Lingered CD59-TM cDNA

Lane3：CD59-TM cDNA digested with Pst Ⅰ

Lane4：pGEM-CD59TM digested with EcoR Ⅰ

2.3 克隆片段的DNA序列