摘要使用一对IgV_H通用引物，应用RT-PCR技术，从分泌抗人C1q McAb的B₆杂交瘤细胞株总RNA扩增出一387bp的DNA片段。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似（同源）的序列。但检索结果表明，它与鼠的多种基因及鼠、人Ig超家族的某些基因序列有一些相似性。对来自鼠杂交瘤细胞的未知DNA片段的克隆与分析，将为以后的基因工程抗体方面的研究提供一些线索。

中图号R392．1

CLONING AND ANALYSIS OF AN UNKNOWN DNA

FRAGMENT FROM HYBRIDOMA CELL

SECRETING McAb AGAINST HUMAN C1q

Wang Qing，Zhu Xihua

（Department of Immunology，The Third Military Medical University，Chongqing 400038）

AbstractUtilizing standard RT-PCR with a pair of primers derived from framework 1 and framework 4 consensus sequences of immunoglobulin heavy chain variable domains，we amplified a 390bp±DNA fragment from the total cellular RNA of hybridoma cell B₆ secreting specific McAb against human C1q．The PCR fragment was then directionally inserted into the vector pGEM-11Zf^（－）．Nucleic acid sequence was determined by DNA sequencing and characterized by computer-aided sequence homology analysis．The results showed that：（i）The DNA fragment consists of 387 nucleotides．（ii）It is not identical or significantly similar（homologous）to any of the published sequences，but it is very close to many mouse genes and some Ig superfamily genes of human and mouse．The cloning of the unknown 387bp fragment from mouse hybridoma cell will give some help for the later gene engineering antibody research market．

Key wordsHybridoma，C1q，McAb，Cloning，Sequence analysis

本研究利用PCR技术，选取本室制备的分泌抗人C1q McAb的B₆杂交瘤细胞株进行可变区（Ⅴ区）基因的克隆、测序，为探讨Ⅴ基因的作用及进一步研制抗人C1q小抗体提供有益的指导。结果利用合成的一对IgV_H通用引物，从抗人C1qB₆杂交瘤细胞总RNA经RT-PCR扩增得到一387bp的DNA片段。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似（同源）的序列。现将实验过程及结果披露如下，并对该未知DNA片段进行初步分析与讨论。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞株、质粒及菌种：鼠杂交瘤细胞株B₆，分泌抗人C1q McAb（IgG₁），由本室制备及保存^［1］。质粒pGEM-11Zf^（－）、大肠杆菌JM109由本室保存。

1.1.2 试剂：RNA酶（Promega，美国），逆转录酶（Gibco BRL，美国），Taq DNA聚合酶（Promega，美国），PCR引物（中科院上海细胞所），低熔点琼脂糖（华美公司），限制性内切酶EcoR I、Sal I（Promega，美国），T₄ DNA连接酶（Promega，美国），小量制备质粒试剂盒（Bio-Rad，美国），DNA测序试剂盒T₇ Sequence Kit（Pharmacia，瑞士）。

1.2方法

1.2.1复苏及扩增培养B₆杂交瘤细胞：按常规方法进行。

1.2.2提取B₆杂交瘤细胞总RNA：参照Chomczynski^［2］方法进行。

1.2.3PCR引物的设计：本实验所用引物是根据Orlandi^［3］等设计的通用引物顺序，在5′和3′端分别引入Sal I、EcoR I酶切位点，以利于扩增的DNA片段定向克隆进测序载体。

1.2.4RT-PCR扩增：首先依反转录cDNA第一链合成Kit合成cDNA第一链，再设定循环参数进行PCR反应：在100μl的反应体系中加入适量逆转录产物（RNA*cDNA），2μl dNTPs（10mmol），10μl MgCl₂（15mmol），扩增V_H的正、反向引物（26pmol／μl、23pmol／μl）各1μl，10μl10×buffer，95°C变性10min后，加入Taq DNA聚合酶3μl（1u／μl），而后进行如下循环：93°C变性1min、55°C退火1min、72°C延伸1．5min，33次循环后，72°C继续延伸10min。扩增产物于2％琼脂糖凝胶电泳观察。按分子克隆^［4］的方法，用低熔点琼脂糖（LMA）凝胶挖块回收法回收PCR扩增片段。

1.2.5PCR产物克隆进pGEM-11Zf^（－）：克隆策略见图1，经氨苄抗性、α-互补颜色筛选法初筛重组子，EcoR I、Sal I双酶切和PCR扩增法进一步鉴定。

图 1PCR扩增片段克隆进pGEM-11Zf^（－）质粒载体

fig 1Cloning of PCR product into plasmid pGEM-11Zf^（－）

1.2.6DNA序列测定及分析：以小量制备质粒试剂盒制备重组子模板，用Sanger的双脱氧链终止法，以pUC／M13正向引物、V_Hback引物分别从二头对PCR扩增片段进行手工序列测定。通过计算机网络系统，借助BLASTX、TBLASTN、TBLASTX、FASTA等程序对获得的DNA片段进行GenBank、EMBL、DDBJ、PPB等序列数据库的类似性检索。

2结果

2.1杂交瘤细胞总RNA的提取、鉴定图2示不同批次提取的细胞总RNA，清晰可见其内对照标准28S、18S、5S三条带和位于18S附近呈云雾状的mRNA，说明所提细胞总RNA是完整的。

图 2杂交瘤细胞总RNA

Fig 2Total RNA of B₆ hybridoma cell

Lane 1：5SRNA MarkerLane 2～4：Total RNA of B₆ hybridoma cell from different batches

2.2RT-PCR经PT-PCR扩增产生一条390bp^±的DNA片段，但可见非特异性连续梯度带的出现，见图3。

图 3RT-PCR扩增产物电泳图谱

Fig 32％ agarose gel electrophoresis of the PCR pro-ducts

Lane 1：390bp^±band with non-specific continous bands；

lane 2：DNA small molecular weight marker（bp）：

501／498，404，331，242，190，147，111／110

2.3重组子的筛选与鉴定在转化平皿上，挑取氨苄抗性白色菌落，扩增后小量快速抽提质粒，以EcoR I单酶切后，1.2％琼脂糖凝胶电泳观察到有DNA滞后带，说明可能是因插入外源DNA而成为分子量增大的重组子。对可疑阳性重组子进行EcoR I、Sal I双酶切，2％琼脂糖凝胶电泳可见切下390bp^±的小片段DNA（见图4）。挑取阳性重组子作PCR扩增，获得390bp^±的DNA片段（见图5）。

图 4可疑阳性重组子双酶切电泳图谱

Fig 42％ agarose gel electrophoresis of recombinant DNA digested by EcoR I and sal I

Lane 1，2，4，5：390bp^±band

Lane 3：DNA Small molecular weight marker（bp）：

501／498，404，331，242，190，147，111／110

图 5阳性重组子PCR扩增产物电泳图谱

Fig 52％ agarose gel electrophoresis pattern of recombinant DNA after PCR

Lane 1，2，4，5：390bp^±band

Lane 3：DNA Small molecular weight marker（bp）：

501／498，404，331，242，190，147，111／110

2.4PCR扩增片段序列测定PCR扩增片段序列测定结果表明，该DNA片段的长度为387bp（见图6、图7）。

图 6DNA序列的放射自显影图

Fig 6Autoradiograph of the insert containing clones

图 7PCR扩增片段序列