A NON-RECEPTOR PROTEIN-TYROSINE KINASE

Tec家族是近几年国外研究较活跃的胞浆内酪氨酸蛋白激酶分子，它们主要在淋巴细胞和髓样细胞中表达。该家族成员有Btk、Itk／Tsk／Emt、Tec、Txk和Bmx，其结构具有高度同源性，均由PH结构域、SH3、SH2及激酶结构域组成，其N端缺乏疏水性跨膜结构，而C端缺乏负性调节区。它们所介导的信号转导主要在免疫细胞的分化、发育、增殖和凋亡过程中起着重要的作用。本文从Tec家族的结构特点及其功能方面作一简要综述。

1Tec家族的结构特点

BTK从结构上可以分为4个结构域^［1］：①独特的N-端结构域，由100个左右的氨基酸构成PH（PleckstrinHomolgy）结构域，紧接着80个氨基酸残基的Tec同源区（TH）。PH结构域有3个功能：N-端与磷酸脂类相互作用如PIP2和IP3；C-端螺旋区与TH基序区共同构成能与异源三聚体G蛋白βγ亚单位的结合区；PH结构域中的Tec同源区是结合Lyn激酶的区域。②SH3结构域由约49个氨基酸构成，SH3结合位点具有选择性，主要与富含脯氨酸区域的蛋白质相互作用。③SH2结构域由约96个氨基酸残基构成，能够识别具有特殊肽序的磷酸化的酪氨酸残基。缺失分析研究表明这些结构域涉及到分子间识别和激酶活性的调节，在信号转导中具有很重要的作用。④催化结构域，也称SH1结构域或激酶结构域，由250个氨基酸残基构成。这些催化结构域具有激酶的特性，有自我磷酸化和磷酸化其它底物的位点。⑤Btk的N端缺乏疏水性氨基酸的跨膜结构域及第二位的甘氨酸残基，该残基作为豆蔻酸序列和膜的“锚”定位点，C端缺乏酪氨酸的负性调节位点^［2］。这些结构是其功能的基础（见图1）。

图1Tec家族的结构示意图

Fig 1Simplified diagram of structure of Tec family

2Tec家族成员的功能

2.1在B细胞分化、发育中的作用1952年儿科医生Bruton首次描述了一种性基因连锁遗传的丙种球蛋白缺乏症（XLA）。直到1993年，Vetrie^［3］等人采用酵母人工染色体（YAC）克隆系统，从人的B细胞cDNA中直接筛选基因，得到的基因能编码一种分子量为77kD的蛋白酪氨酸激酶，并且在患有XLA的病人中均能检测到点突变或缺失突变，表明在B细胞发育过程中，该基因与XLA疾病有直接的相关关系。同年，Thomas^［4］，Rawlings^［5］等发现从载有xid（X-linkedimmunodeficiency）突变小鼠的YAC系统筛选得到的基因与人的XLA的座位基因（btk）电泳比较可知：两者基因均位于Xq染色体，主要在B淋巴细胞中表达。采用该病的第一发现者Bruton命名为Btk（Bruton’styrosinekinase）。btk基因突变的结果造成人类的XLA疾病和小鼠的xid疾病^［3～5］。该类患者多呈家族性分布，常伴有染色体异常。病人骨髓中有正常数量前B细胞，但血循环中缺乏成熟B细胞和所有的血清免疫球蛋白。表明XLA发生的原因是由前B细胞发育为成熟B细胞的过程中发生障碍所造成的。这是由于骨髓中前B细胞分化为成熟B细胞过程中，蛋白基因结构要完成基因重排（VDJ），并受到多种酶的调节，这一分化过程还依赖于多种受体和细胞因子，而Btk可能是这些信号转导途径中的关键分子。通过剔除（knockout）btk基因研究发现^［6］：突变发生在Btk的不同结构域，其病变的轻重程度也表现不同。PH结构域突变影响功能具有关键性作用，如xid小鼠是由其PH结构域的第一位点突变所造成，大部分突变集聚在N端的膜结合区。SH3结构域和SH2结构域的突变，对Btk的功能影响较小。激酶结构域是Btk中最大一个结构域，也是结合底物完全催化功能所必须的结构区域。几乎一半突变出现在该区域，大部分突变位点影响激酶区域的Arg520和Arg525，较严重的XLA其突变点主要在ATP结合区，远离功能区域的位点引起的XLA较轻。突变形成后，Btk活性降低或丧失。当外界抗原与BCR交联时，可以激活Btk，但不能发挥其向下游传递信号的功能^［7］，信号转导发生障碍，最终不能引起B细胞的活化、增殖，从而使其不能发挥其生物学功能。这些结果表明：在B淋巴细胞正常发育过程中，btk基因不同蛋白区域的正确表达在B细胞的功能及多种转导途径中具有关键性作用。

2.2在T淋巴细胞分化发育中的作用1992年Siliciano等^［8］从IL-2刺激后的鼠杀伤性T细胞（CTLL-2）的cDNA中扩增、克隆出基因库中还未发现的一种蛋白酪氨酸激酶（PTK）的新基因，称为Itk（forIL-2inducibleT-cellKnase），并证实了该基因主要在T淋巴细胞中表达。研究表明：Itk在胸腺T淋巴细胞中表达量较周围免疫器官T淋巴细胞高，而且随着小鼠从新生到成年的发育和分化过程中，Itk表达也随着增加（＞5倍）^［9］。Itk缺陷能造成T细胞为主的免疫缺陷疾病，如脊髓发育不全综合症和白血病。因此，Itk在胸腺发育和成熟T细胞的生长调节中起着重要作用。另一方面在T细胞激活过程中，CD3分子交联不引起Itk的激活，CD4、CD2的交联能引起Itk和Lck的激活，导致Itk的磷酸化及激酶活性的增加，同时也激活了淋巴因子基因的转录增强子。这是由于CD28反应元件（CD28RE）在IL-2启动子的上游，当与CD28反应后的下游复合物（CD28RC）分子在细胞核内与CD28RE结合时，激活ITK／TSK／EMT基因的同时，也激活IL-2等多种淋巴因子的基因，继而ITK募集PI3K再激活其下游分子，这种信号转导功能能够增加IL-2等因子的mRNA半衰期。Sigrid等研究认为^［10］，Gβγ的偶联引起Itk等PTK的磷酸化，再募集适配蛋白，激活SOS和Ras-Raf-MAPK途径，MAPK通过丝／苏氨酸的磷酸化又能激活AP-1和其它转录因子。这个过程能被PTK抑制剂所抑制,表明Itk参与该途径的信号转导（见图2）。

图2信号通过Fc ε RI受体在肥大细胞中的转导途径

Fig 2A schematic illustration of transduction pathway in the mast cell that signal pass the Fc ε RI receptor

2.3在肥大细胞信号转导中的作用肥大细胞表面约有10万个高亲和力的Fc ε RI，当变应原刺激体内B细胞产生LgE后，相应变应原与肥大细胞表面LgE／Fc ε RI复合物结合可使胞浆内的Btk磷酸化，再将信号传递到下游分子。实验证实^［11］：Fc ε RI与PTK如Lyn、Syk相连，当Fc ε RI交联后，引起Lyn和Syk的自我磷酸化，再激活了磷脂酶C（PLC）和Src激酶。PLC激活后产生效应分子，如甘油二酯（DG），继而激活蛋白激酶C（PKC），再经过Btk的PH结构域介导与Btk相互作用。该作用表现为：PKC对于所介导的Btk磷酸化具有下调作用，且引起Btk自我磷酸化活性降低^［7］。而通过PLC活化的PKC作用于Itk的PH结构域，使Itk分子中的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化导致其激活，在Ca^2＋依赖PKC同工酶过表达的情况下，ITK的酪氨酸磷酸化也明显升高。该过程可以被PKC的抑制剂所抑制。Btk在体内只能与PKCβI相互作用，而Ιtk能够结合于多种PKC同工酶，如PKCα，－βI，－βⅡ，－ε，－ζ或－θ同工酶。Fc ε RI交联后，PKC磷酸化Btk而抑制其活性，但Itk被PKC磷酸化后，可改变ITK的构象，使它更易被其它激酶磷酸化而激活其酶活性。PKC调节的酪氨酸磷酸化的两种PTK，其相反结果的机制还不清楚，也许是与不同的同工酶作用的结果，也许PKC在两者的磷酸化位点不同。Fc ε RI交联的同时也引起Src蛋白激酶发生自我磷酸化，通过与Btk的SH3和SH2相互作用激活Btk，Btk通过其SH3区的第223位酪氨酸的自我磷酸化而激活，这种自我磷酸化对于Btk的催化功能是必须的^［12］。可以看出肥大细胞表面受体交联引起Btk激活过程中，PKC和Src蛋白激酶对于Btk的磷酸化起着直接或间接的调节作用。除此之外，FcεRI的交联还与G蛋白偶联受体有关^［10］。采用共转染分析，Btk、Itk能被Gβγ亚单位所激活，两者之间通过Βtk、Itk的PH结构域与Gβγ相互作用。G蛋白偶联受体激活Ras的过程能被酪氨酸激酶抑制剂所抑制,这些实验证明酪氨酸激酶家族与G蛋白有直接相关关系。Gβγ亚单位直接激活酪氨酸激酶可能起到一个连接作用，通过Gβγ亚单位激活BTK、ITK后，能够募集适配蛋白，将信号转到Sos和Ras-Raf-MAPK途径，再激活其下游分子（见图2）。

2.4其它成员的功能Btk在射线诱导的细胞凋亡中具有重要的作用。细胞凋亡作为一种生理现象，在胚胎发育、造血和免疫系统的成熟以及维持正常组织和器官的细胞数目恒定与生长平衡，乃至机体衰老方面都发挥着重要的作用。B细胞凋亡涉及到PTK的激活，不同因素启动不同的PTK导致不同途径的凋亡，Btk在射线诱导的凋亡中起着重要作用^［13］。该实验采用DT-40细胞，此细胞是一种对放射线敏感的鸡淋巴细胞，经过射线诱导后从凋亡的DT-40细胞中可以检测到一种分子量为77kD的蛋白酪氨酸激酶。实验证实：参与射线诱导的DT-40细胞凋亡的酶是Btk，而不是Src家族的Lyn和ZAP70家族Syk激酶（该两种酶也存在于B淋巴细胞中）。通过同源重组剔除DT-40细胞中btk基因，射线不能诱导其凋亡，而Btk对于DXM等化疗剂诱导的凋亡信号就不是必须的。另一方面Btk的不同结构域在介导射线诱导的凋亡信号中的作用也不相同，如果催化结构域突变，DT-40细胞经射线照射后就不能诱导凋亡，而SH2或PH结构域对于射线诱导的凋亡作用并非是必须的。B淋巴细胞在个体发育中的多个凋亡校正点是为了保证其正常<