凋亡是一种不同于坏死且受控于基因调节的细胞主动消亡过程，是机体赖以维持内环境稳定的重要机制。由于对这种新的细胞死亡模式的研究有助于理解诸如胚胎发育、自身免疫耐受、细胞群体稳定等重要生命现象，并对肿瘤、艾滋病及自身免疫性疾患的认识、治疗存在潜在应用价值，因而有关细胞凋亡的研究很快成为生命科学中的前沿领域之一。

遗传学研究提示，虽然诱导细胞凋亡的信号各异，但其生化特征及死亡通路在进化中存在高度保守性，一般须经过凋亡诱导－调控执行－效应三个阶段。当细胞走向凋亡后，在不同的时相里，细胞的整体形态、膜表面的脂类成份、一般生化特征、胞内相关的蛋白酶水平及凋亡调控基因表达都会出现明显改变。本文仅就与凋亡研究相关的方法做一简单探讨。

1细胞标记形态学研究

1972年Kerr根据形态学的变化将凋亡细胞与坏死细胞区分开来。凋亡早期形态学改变是核染色质固缩，聚集于核膜周边，胞浆浓缩、质膜出芽，继而核裂解、凋亡小体形成。而坏死细胞肿胀、胞膜破裂、崩解。形态学鉴定凋亡主要涉及下面几个方面。①传统的染色标记： 如姬姆萨瑞氏染色后，高倍镜下可将凋亡与坏死细胞区别开来； ②利用质膜完整性的差异，采用台盼蓝，碘化丙啶(PI)、溴化乙锭(EB)等膜不通透性染料对细胞进行标记，根据坏死细胞核着色，活细胞及凋亡细胞不着色的特点区别凋亡与坏死； ③根据质膜通透性的差异标记凋亡细胞，Hoechst 33258、Hoechst 33342 等为膜通透性荧光染料，可使凋亡细胞着色浓密，荧光显微镜下可以鉴定凋亡细胞； ④由于凋亡细胞的形态学变化发生在超微结构，光镜观察难以令人满意，采用透视电镜可以清楚观察到细胞结构在凋亡不同时期的典型变化。形态学仍然是迄今为止判断凋亡最经典而可靠的方法，但只能定性，也不适于大量样本检测。

2检测凋亡细胞膜表面标记的改变

凋亡细胞早期即可出现质膜表面的改变。由于凋亡信号刺激触发胞内Ca^2＋水平升高，激活ATP非依赖型爬行酶(ATP－independently operating scramblase),加速膜内磷脂组分的双向运动，导致膜质双层不对称性的丧失，最突出的变化是磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)暴露于膜的外表面。AnnexinⅤ(膜联蛋白)是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲合力，这种蛋白可作为一种检测PS暴露于细胞表面的敏感探针。目前荧光或生物素标记的AnnexinⅤ已被应用^［1］。如利用荧光素FITC直接标记的AnnexinⅤ与凋亡细胞共同孵育，由于标记的AnnexinⅤ可以与PS特异结合，可通过直接检测AnnexinⅤ的荧光强度来反映细胞凋亡的比例。但坏死时细胞结构破坏，PS也暴露于细胞外表面，因此单独使用Annexin Ⅴ不能区分细胞坏死或凋亡，同时采用PI这一标记坏死细胞的染料，利用流式细胞仪可在同一时相内将活细胞、凋亡细胞、坏死细胞加以定量分析：正常活细胞AnnexinⅤ、PI荧光强度均低，凋亡细胞AnnexinⅤ荧光强度高、PI低，死亡细胞AnnexinⅤ、PI荧光强度均高。由于细胞凋亡时膜上PS外露早于DNA断裂，因此该法检测早期凋亡较TUNEL法更灵敏，晚期凋亡影响因素增多，即便结合膜通透性发生改变，凋亡和坏死仍难以区分。

3检测染色质的改变

在许多细胞系中，凋亡细胞的形态变化总是伴随着内源性核酸内切酶激活所介导的染色质断裂。凋亡细胞DNA这种选择性地在核小体之间断裂与坏死细胞的DNA在任意位置上发生断裂是完全不同的。核酸酶的作用位点位于两个核小体的NDA联接区域，激活的核酸酶对联接区域的一段DNA双链或单链发生酶切反应，形成单一(180-200bP)或寡聚的核小体(180-200bp的倍数)，在琼脂糖凝胶电泳图上清晰地可见“梯状”(DNA ladder)这一凋亡特异降解结果，这一直被当作凋亡细胞的生化标志，尽管最近已有证据表明细胞凋亡并不一定伴有DNA ladder出现^［2］，但不能否认NDA特异降解发生于大多数凋亡细胞中。

凋亡过程中核酸内切酶的研究一直是凋亡研究的主要方向之一，已报道的核酸内切酶有4-5种之多，但并没有明确证据表明哪一种是直接引起DNA特异断裂的酶。1998年Enari等报道的CAD目前被认为是直接引起DNA ladder的DNA酶^［3］。Caspases活化的DNA酶(caspases activiting NDase,CAD)可以直接被Caspase-3激活，引起染色质的特异切割。

目前分析染色质改变的方法主要有下面几个方面：①DNA片段琼脂糖凝胶电泳分析：采用常规的染色体DNA抽提方法。在含EB的琼脂糖凝胶电泳上呈典型的“梯形条带”是凋亡细胞，正常细胞为单一完整DNA条带，而坏死细胞由于DNA随机断裂并伴组蛋白降解，凝胶上呈梯形的膜状条带。采用同位素³²P标记DNA的5’端(T4噬菌体多核苷酸激酶)或DNA粘性末端(KLenow 聚合酶)通过放射自显影术，可以大大提高检测敏感性并可定量检测。②TUNEL及ISNT标记技术^［4］：进入90年代，国内外最常用的凋亡定量标记检测是切口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase TdT dUTP nick end labeling,TUNEL)和原位切口平移(in nick translation,ISNT)技术。TUNEL是凋亡细胞DNA断裂后， DNA 3’端可在末端脱氧核苷酸转移酶作用下，与FITC或digoxingenin或生物素等标记的dUTP相结合;ISNT是在DNA聚合酶I的作用下，将生物素等标记的核苷酸原位掺入DNA的缺口，利用流式细胞仪或荧光分析仪，通过对荧光强度的分析来定量测定DNA的断裂程度。TUNEL既可标记双链、亦可标记单链断裂DNA，而细胞凋亡时，双链DNA断裂发生要早于非特异性DNA断裂，且明显多于单链DNA断裂，坏死细胞早期虽然亦可发生DNA随机断裂，但与凋亡细胞相比相当弱，因此TUNEL对于早期凋亡检出更为适用。ISNT主要用于NDA单链断裂的检测且可放大断裂信号，坏死时DNA单链断裂较多，判断坏死ISNT应该较优。联合两种方法标记，结合其它检查可以确定主要死亡模式，从而有利于认识细胞的死亡机制。③ 检测NDA含量的PI染色标记： 流式细胞仪定量凋亡细胞的方法多种多样。Nicoletti^［5］等的PI染色是其中的经典方法。细胞凋亡时，DNA断裂成小片段，当细胞经乙醇或TritonX-100 处理后，胞膜出现孔洞，小片段DNA可从细胞内释放出来， 使胞内DNA含量低于正常细胞的二倍体。 PI染色后， 流式细胞仪检测荧光标记的DNA含量， 可在DNA直方图上出现DNA含量减少的亚二倍体峰，经证实该区的细胞即凋亡细胞。该方法简单易行，因此成为80年代最为常用的凋亡定量检测方法。但其敏感性差，首先，凋亡早期NDA丢失不明显，难以分辨出亚二倍体峰，其次，晚期凋亡，坏死与之共存，且细胞周期中的细胞均出现不同程度的减少，亚二倍体细胞量多少不等，难以分辨。PI与Hoechst33258或Hoechst33342双标记后检测可以弥补PI单标记的不足。

4凋亡相关分子的检测

细胞凋亡鉴定的最终目的是希望了解凋亡信号的传导机制，因此当某一信号刺激引起的凋亡被确定之后，进一步由凋亡所引起或伴随的胞内相关信号分子的变化引起人们极大关注。目前，在细胞凋亡的信号调节中被认为有三个关键的调控关卡(check points): 半胱天冬酶(caspase 蛋白酶)家族、bcl-2 基因家族及线粒体。这些分子间的相互作用，对于共同的凋亡通路有极其重要的影响^［6］。①凋亡蛋白酶及其底物检测： 凋亡蛋白酶家族，即ICE/CED-3 或 caspases 蛋白酶家族，是1993年袁钧英等首先报告的(ICE,interleukin β-converting enzyme, 即 caspase-1)，这是细胞凋亡研究中的重大进展，^［7］,至今至少已发现了13个成员，它揭示了凋亡通路中的关键调节点。目前，测定caspase 蛋白酶活性的方法已经得到应用，如Clontecch 公司的Caspase-3，Caspase-8检测试剂盒，利用caspase 蛋白酶特异切割荧光或色素标记的底物后产生荧光色彩或光谱波长的改变，再通过荧光分析仪或色谱分析仪来测定蛋白酶活性；利用caspase蛋白酶单克隆抗体与相应蛋白产生免疫作用(如Santa Cruz 公司产品)，经过免疫印迹(western blot)进行蛋白酶前体及活性亚基分析(如Procaspase-3,P20，P10亚基)。PARP(聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶)是Caspase-3特异作用底物，在凋亡早期，PARP即可发生切割，由完整的116kd形成85kd的“凋亡带”，应用PARP单抗通过western blot进行凋亡的早期鉴定已得到应用，并可提示此凋亡与caspase蛋白酶偶联。②凋亡相关基因检测： 与凋亡密切相关的基因家族中最重要的是bcl-2基因家族，至今已发现了15个成员，可分为抑凋和促凋两大亚类。其它如P53基因，c-myc等等皆与凋亡密切相关。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及western blot等方法，可进行相关基因mRNA及蛋白质表达水平的检测。线粒体与细胞凋亡密切相关是近年才引起人们极大关注。线粒体膜通透性转换、细胞色素C等测定目前主要集中于离体试验，完整细胞状态下的研究，如CytC的测定，须经梯度离心等胞浆特异抽提，同时应考虑线粒体污染。

总之，检测细胞凋亡的标记分析方法很多，单一标记免疫分析法往往有很多局限，多层次的考虑对深入研究细胞凋亡具有重要意义。

参考文献：

［1］ Vermes l, et al. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin Ⅴ［J］.J Immunol Methdos, 1995,184:39.

［2］ Cohen l l. Apoptosis: physiologic cell death［J］. J Lab Clin Med,1994,124:761.

［3］ Enari M,et al. A caspase-activated Dnase that degrades DNA duing apoptosis, and its inhi