近年来，标记免疫分析技术的研究和应用取得了许多新的进展^［1］。尤其非放射标记免疫分析技术的自动化已推广应用于临床。如化学发光免疫分析(CLIA)，酶免疫分析(EIA)，时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)以及最近问世的电化学发光免疫分析(ECLIA)等的各项技术指标已达到或超过RIA，有些临床常规检测项目将取代RIA。RIA研究的现状及今后前景如何是人们关注的热点。本文就这一问题简述个人的见解。

一、试管固相RIA和IRMA技术研究进展

在RIA和IRMA技术研究中，推广试管固相法是发展的方向。其主要优点是抗原和抗体反应后经洗涤即直接测量试管的放射性，简化了操作程序，实现了一步法。

1试管固相制备新工艺

固相抗原或抗体制备主要采用的是物理吸附，方法简易，但包被蛋白质的量很微，均一性和牢固性欠佳。1990年Causse等^［2］应用顺丁烯二酸酐一苯乙烯共聚体活化聚苯乙烯塑料管，以共价键结合制备试管固相抗体，测定血清T₄取得了满意结果。因活化方法比较复杂，不便推广。最近国外已研制出用仲氨基和琥珀酰亚胺活化塑料管，专用于共价键结合包被抗原和抗体以取代常规物理吸附。这两种活化试管是理想包被载体，近期可能有产品投放市场。目前国内外市场上生产的试剂盒，多数采用了自行设计试管包被工艺，基本上可以满足常规检测项目的要求，如采用化学结合法包被，试管固相RIA试剂盒的质量必将提高到一个新的水平。

2试管固相放免反应原理

早期的IRMA技术反应模式只有一种双位点夹心法，仅限于检测蛋白质类高分子化合物。试管固相RIA问世后，为了它适应各种物质的检测，人们设计出多种免疫反应模式，其反应原理各异，主要有下列几种类型。

2.1 试管固相亲和素多层夹心法将生物素(Biotin)、亲和素(Avidin)系统引入免疫分析是方法学上新的进展，进一步提高了检测的灵敏度。先按常规方法包被制成固相亲和素管，以测血清TSH为例，将一株抗hTSH单抗(McAb)生物素化，另一株McAb标记¹²⁵Ⅰ。测定时，将样品和两种标记McAb加至固相亲和素，温育后洗涤，测量固相管的放射性。本法对hTSH的最小检出值为0.01μIU/mL。生物素化McAb可长期保存，固相亲和素管可通用。

2.2 固相二抗竞争法作者于1992年首先将通用试管固相二抗应用RIA^［3］，使用于多项指标的检测。首先将羊抗兔IgG包被试管，凡第一抗体为兔抗者均可通用。以测定αFP为例，将待测血清、¹²⁵Ⅰ-αFP和第一抗体加至固相二抗管中温育，洗涤后测管的放射性。

2.3 固相亲和素竞争法将高滴度的抗血清提纯IgG后，进行生物素化处理。测定时，取样品、¹²⁵Ⅰ标记抗原和生物素化抗体，加至固相亲和素管中混合，温育后洗涤，测量管的放射性。

2.4 固相抗体竞争法此法需高滴度的抗血清(通常1∶5万以上)，按常规方法提纯抗体IgG，经筛选确定最佳包被抗体浓度。然后制成固相一抗试管。测定时将样品和¹²⁵Ⅰ标记抗原各50μL加至固相一抗管中温育，生成固相抗体抗原免疫复合物，洗涤后测放射性。本法要求包被抗体量高度均一，否则重复性欠性。

2.5 固相双层抗体竞争法这是一种改良固相抗体竞争法，一抗不必纯化，直接按液相法的滴度稀释，其抗体滴度高低不限。首先制备固相二抗管，管壁上二抗对一抗而言是过量的，将一抗稀释液加至二抗管中，以免疫反应将一抗IgG结合至管壁上，完全克服了固相一抗制备均一性欠佳的缺点。测定时将样品和¹²⁵Ⅰ标记抗原各50μL加至固相抗体管中温育，洗涤后直接测管的放射性。

2.6 固相半抗原竞争法作者等于1994年建立这一模式测定血清甾体激素，其主要优点是适宜于待测抗原无可供¹²⁵Ⅰ标记的基团或标记物不稳定或有效期短的化合物。先将半抗原和蛋白质结合物包被试管，可不必经封闭，加无水乙醇固定。虽蛋白质变性，但甾体激素类、甲状腺激素类和环核苷等，小分子半抗原的免疫活性不受影响，且可长期保存。其原理是固相半抗原和液体中的待测物共同竞争性地与¹²⁵Ⅰ标记抗体结合。测定时将样品和¹²⁵Ⅰ标记抗体加至固相半抗原管中温育，洗涤后测放射性。

2.7 固相二抗非平衡法本反应模式是一种改良通用固相试管二抗法。其主要目的是提高方法的灵敏度，以适宜检测血浆中浓度较低的物质。以测定血浆内皮素(ET-1)为例，取血浆250μL，第一抗体50μL加至固相二抗管中温育。吸出管内液体弃去，向管内加¹²⁵Ⅰ-ET,1 2.5万cpm/300μL，再次温育后洗涤，测管的放射性。

2.8 同一固相管内测定两种化合物早在20年前就有作者建立在一支管内同时测两种化合物，因受当时技术条件所限未达实用条件。近年来，由于固相抗体制备技术所取得的进展，以及McAb的应用，这一设想成为现实。以测定αFP和CEA为例， 其原理和技术程序如下： (1)将抗αFP McAb包被试管，另将抗CEA McAb包被塑料珠；(2) 取羊抗αFP IgG和兔抗CEA IgG分别标记¹²⁵Ⅰ；(3) 测定时，取抗CEA 珠一枚加至抗αFP固相管中，即刻向管内加待测样品100μL，补加实验缓冲液100μL，摇匀后温育；(4) 吸去管内液体，然后加两种¹²⁵Ⅰ标记抗体各100μL，再次温育。经充分洗涤后，分别测量管和珠各自的放射性，即可得出αFP和CEA的浓度。

3影响检测结果的主要因素

3.1 载体包被管的质量是影响结果的主要因素^［4］。目前应用最多的是以聚苯乙烯为原料制成的专用试管，不同原料制成的试管吸附蛋白质的量有较大差异。对每批试管的包被蛋白的均一性必需做质量检验。检验方法是取包被抗体IgG管，加过量¹²⁵Ⅰ标记抗原，温育后洗涤，测放射性，批内CV＜3%(10例)为合格。如采用仲氨基或琥珀酰亚胺基活化的包被管，以共价键结合法，试剂盒的质量必有显著提高。

3.2 包被蛋白质的量通用固相二抗法和IRMA法，包被抗体的量对第一抗体或待测抗原而言，必须是过量的。否则将影响标准曲线剂量范围和双管平行性。为此，许多作者采用各种不同途径提高包被量，如γ射线辐照，双功能活性基因化合物处理(戊二醛、丙烯醛)等，但并不十分理想。目前唯一可行的途径是采用高滴度抗血清，提取抗体IgG来满足方法学的要求。

3.3 抗体的质量试管固相RIA对抗体质量有严格要求，除高滴度和高特异性外，必须要具备有高亲和力。因试管固相抗体抗原反应达到平衡的反应时间比液相要长，因为具有高亲和力的抗体，可以在较短的时间内达到平衡。这既缩短了温育时间，又可提高方法的灵敏度。

4固相抗体保存条件

实验结果证实，试管固相抗体经加膜化处理，密封于塑料袋内有效期一年。经抽直空密封保存，至少2年固相抗体不失活。

二、生物活性肽测定方法的新进展

近年来，在生命科学研究中，有关生物活性多肽与生物医学的关系取得许多新的进展。 如应用肽合成仪可以合成发现的新肽类化合物及其不同片段，为研究肽的不同片段的生物活性及其与某些疾病发生的关系提供了条件。因此，对测定方法的研究和改进已成为必须解决的课题。这从而加速了方法研究的新进展。

1生物活性肽的IRMA

生物活性肽包括一类化合物。参与机体多种生理功能的调节，与心脑血管疾病、内分泌系统疾病等的发生发展关系密切，常规RIA特异性差，所得值多为免疫反应样物质。IRMA技术是一项高特异性、高灵敏度方法。以最近发现的肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)测定为例，ADM是由52个氨基酸残基组成，取1-12和22-52两个片段分别与牛甲状腺球蛋白(bTG)结合为免疫原，制备相应抗体。以22-25片段抗体包被制成试管固相抗体，1-12片段抗体IgG作¹²⁵Ⅰ标记。测定时，将样品和¹²⁵Ⅰ标记抗体加至固相抗体管中温育，生成固相抗体夹心复合物，洗涤后测量放射性强度。

2多肽片段抗体的应用

一些分子量较大具有多位点的肽类，利用其片段为原料制备的抗体，可以与肽类完整的分子及其片段呈现特异性免疫反应。利用这一具有类似McAb的抗体特性可以建立竞争性RIA。例如人的降钙素基因相关肽(hCGRP)是由37个氨基酸组成，MW3786.9。荣阳等利用片段抗体所建立的RIA方法，所测得正常参考值和文献报告相同。

3提高测定方法灵敏度的可行性

有些生物活性肽在血清中的浓度甚低，用常规方法不易将其检出时，可以采用间接途径，提高样品的最小检出值^［5］。

3.1 微柱提取法取Weters碳18硅烷柱，依次用蒸馏水30mL,75%甲醇(含0.1%三氟乙酸)和10mL蒸馏水淋洗。取血浆4mL,加0.1%三氟乙酸10mL,混匀后放10min，3500r/min离心15min。将上液加至柱中，用30mL蒸馏水淋洗，流出液弃去。向桩中加75%甲醇(含0.1%三氟乙酸)3mL,流出液收集至10mL青霉素瓶中，用电风扇吹干，-20℃保存，测定时用0.5mLPBS溶解。此时样品已浓缩8倍。

3.2 酸性乙醇提取法取血浆2mL，加酸性无水乙醇(含1%冰乙酸)4mL，置混匀器上1min,3500r/min离心15min。将上清液全部倒入10mL青霉素瓶，置45℃蒸发干<