放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)是一种通过比活度(specific activity)高的示踪物，观察抗原与抗体结合反应产物来定量微量物质的一种分析方法。它产生于50-60年代交界，是医学生物学界微量分析中有划时代意义的创新，Yalow, Berson因此获得诺贝尔奖。放射免疫分析的主要原则被广泛运用并发展成为使用各种结合剂(binding reagent), 和使用各种标记物的先进的配体分析(ligand assays)方法。结合剂中，除抗体以外还有血清结合蛋白，受体，酶，单链DNA片段(即寡核苷酸探针)等，其中抗体，尤其是单克隆抗体占最重要地位。但从发展上看，DNA片段在未来将至少与抗体同等重要。在标记物方面，先后出现了一系列非放射性同位素标记物，其中以发光标记的影响最大，它把配体分析推向更高的阶段，甚至有的学者以“从同位素到发光”，来描述放射免疫分析的最新发展。

1配体分析发展的三阶段

本学界权威Ekins教授将自Yalow, Berson建立放射免疫分析以后的发展过程概括为三个阶段^［1］：

1.1 第一阶段开始於50年代末，为第一代，竞争性，放射标记被测物(analyte)的分析方法。它们是以Yalow,Berson为代表的以抗体做结合剂(binding reagent)的胰岛素放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)，和以Ekins为代表的以血浆结合蛋白做结合剂的甲状腺素饱和分析(saturation assay)。第一代配体分析的卓越贡献是，他解决了体液中浓度在10⁷-10¹⁴分子/mL量级以下激素的临床测定，这是当时其它测量方法做不到的。由于该方法的高度灵敏，特异和简便，它的应用很快由激素扩展到血液学，药理学等其它领域，成为60-80年代中期医学分析领域中占统治地位的分析技术。

1.2第二阶段第二阶段A，开始於60年代，由Wide等，Miles,Hales建立了非竞争性，“夹心式”，抗体标记的免疫放射分析法(immunoradiometric assy, IRMA)。第二阶段B，80年代，由Ekins和Wallac Oy合作建立第一个超灵敏，非竞争，非放射性同位素标记单克隆抗体的“解离放大镧系标记荧光免疫分析(DELFIA)”，或称时间分辩荧光免疫分析(Tr-FIA),以及随后其它各种非放射性同位素标记物的应用。

以上A，B两类又可统称为第二代，非竞争性配体分析。非竞争性配体分析诞生后并未立即得到广泛应用，而是经历了： ① 单克隆抗体技术的问世与发展，提供了大量纯一抗体，保证了夹心模式中“扑捉抗体”和标记抗体的需求； ② 各种发光示踪物的利用，以便与超灵敏分析匹配； ③ 非竞争模式的优越性在理论上得到确认。这三个条件的成熟，即到80年代中期，才促成了免疫分析从第一代向第二代的根本转变。一时间，几乎所有制造商都竞相采用了非竞争模式，同时大规模地发展了与之配套的，高产出自动化免疫分析检测仪。

1.3 第三阶段开始於1986年，由Ekins等发展微小型、多分析物的微斑点(microspot)分析，并从1991-1992年与Boehringer Mannheim合作发展第三代超灵敏，抗体或寡核苷酸微点阵(microarray)技术；另外，於1992年在美国开始了另一个长期的发展计划，称为Genosensor Project,该项研究专门用于DNA/RNA的分析。发展这种技术比建立其它分析方法，对制造厂商来讲，具有更大的挑战性，耗时更长，代价更高。小型微点阵技术可以从1-2滴血的小样品中，同时进行数十种乃至千百种物质的超灵敏分析。这种高容量的点阵首先对DNA检测和筛选最具应用价值。尽管这种很大的分析“菜单”在免疫诊断领域中近期内似无大量需求,但是对于输血原的筛选，过敏原的筛查等项目中，小型微点阵技术具有明显的优越性和迫切的需求，这种技术一旦发展成熟，它将为多分析物的检测，提供更方便快捷和低成本的测定条件，并可能逐步取代现行测定系统。

2超灵敏和全自动化的第二代免疫分析

2.1 长期的“灵敏度”论战及其对配体分析发展的影响更高灵敏度的追求启动了放免分析的建立，也是这一追求驱动着免疫分析不断的发展与提高。尽管灵敏度就是最低可测值这一定论无可争议，但对于如何确定这个最低值，以及灵敏度的意义，则有长期的争论。这一论战涉及到免疫分析设计，免疫分析最佳化，甚至它们加速或延迟着配体分析发展的进程，因此，弄清楚这一基本理论是非常必要的。

一部分学者，包括有的国际免疫分析执法机构，把灵敏度单纯视做反应/刺激比率，反应变数(B/F，F/B，B%，等)对被测物浓度［H］的梯度，或认为db/d［H］即暗指测定下限；而Ekins则把灵敏度明确定为被测物浓度零点时的测定精密度，即σH₀＝σR₀/(dR/d［H］)₀，R₀为被测物零点时的反应，(dR/d［H］)₀为被测物零点时的梯度。该式表明，灵敏度与反应误差呈负相关，与曲线梯度呈正相关，正确阐明了灵敏度的本质。这两种理论的根本区别在于后者要求对测定数据的仔细统计分析，以确定不同反应条件和方式下，对灵敏度最有决定性影响的，反应(R)随机误差σR；反之，唯梯度论实际上是忽略了不同的抗体浓度，不同的反应模式(竞争方式与非竞争方式)可以引起大不相同的反应随机误差，从而形成明显不同的灵敏度。对灵敏度概念的误解使得在早期不能正确地认识RIA与IRMA灵敏度的不同。尽管IRMA一问世即声称，它注定比RIA更为灵敏，但缺乏有力论证，很快遭到Rodbard的驳斥，后者又得出另一个混淆竞争与非竞争方式的片面论断。这些认识上的曲折，延迟了第二代免疫分析的普及推广。

2.2 为什么非竞争性模式的灵敏度高于竞争性模式?非竞争性分析是以抗体标记为前提的，但并非所有抗体标记的都是非竞争性分析。判别两类分析模式的标准是“结合位点占据”原则，当抗体进入测定系统时，被测物开始抢占抗体结合位点，所占位点的数量可以直接测得，或间接测得；直接测得者称为非竞争性分析，间接测得者称为竞争性分析。直接测量结果的误差小于间接测量，故直接测量的灵敏度高于间接测量。这好比度量一厘米长度，直接测量一厘米比量一米再量99厘米，取两者之差要精确，误差趋小则灵敏度趋高。这一简单的逻辑在理论上得到了证实。在竞争分析中，如果条件控制在最佳状态，并假定所使用的标记物的比活度为无限大，从而使放射性计数的误差趋於零，则测定所达到的灵敏度可表示为e/K,e为反应(R)的相对误差，K为抗体亲和常数；而在相应的最佳条件下非竞争分析所能达到的最高灵敏度为e/(K×bn),bn为非特异性合。如果bn＝0.01，则非竞争性分析的灵敏度将比竞争性分析高100倍。在实践中，如使用标记物¹²⁵Ⅰ，由于其比活度的限制所造成的放射计数误差，使得灵敏度随着抗体亲和常数增加而升高的幅度越来越小，在保持很低的非特异结合的情况下，在非竞争系统中放射计数误差倾向於取代操作误差成为灵敏度的主要限制因素。因此发展更高灵敏度的非放射性标记物成为发挥非竞争性分析的优越性，进一步提高灵敏度的关键所在。综合以上对各种因素的分析，如要得到切实高于第一代免疫分析的灵敏度，必须要求：① 采用非竞争性方式；②用能使灵敏度远高于传统放射性同位素标记的其他标记物做标记；③降低非特异结合到可能的最低水平，即至少应小于1%，如能小于0.01%则为理想值。

2.3 非放射性同位素标记的自动化快速配体分析在以上理论的推动下，Wallac 采用镧系元素做标记，配以非竞争方式及时间分辩技术，发展了第一个性能优良的非放射性同位素标记的超灵敏配体分析。随之另一些厂家以相同的基本原则，先后发展了多种其它发光标记的超灵敏自动化分析，并迅速占据了免疫诊断领域的主导地位。它们不但解决了一些临床上不断提出的新的灵敏度要求，而且把测定时间从RIA时代的数小时乃至数日的漫长过程，一下子缩短为若干分钟内报告结果，而且不管是一批，还是单个标本都可以随到随测，临床上受益十分突出。超灵敏全自动化还提高了实验室的效率，改进了重复性、可靠性，提高了质控水平，大大改变了临床化学的面貌，是近十几年来本领域中最重要的进步与革新。

3微点阵分析的原理与特性

微点阵分析(microarray assay)使用比传统免疫分析少得多的抗体，固化於极狭小(如10个微米左右)的微斑(microspot)上。当浓度小于0.01/K的抗体进入分析系统时，其结合位点占据率只反映探测位点的抗原浓度，与系统中抗原总量，样品体积无关，称为周围(ambient,指直接包围微斑的部位)抗原浓度分析，它可以对生物样品进行定点测定。实践中使用的抗体量要小于V/K×10^-5×N,V为样品体积(mL)，N为阿伏伽德罗常数(6.023×10²³)。如V＝1mL,K＝10¹¹L/mol,则最大允许的抗体分子数为6×10⁷，假定单层密排抗体密度为10⁴-10⁵分子/μ，则抗体微斑的面积应在100-1000μ量级。反应以后的抗体结合位点占据率用标记抗体进行定量。标记抗体可结合在已经占据的位点，即与捕捉抗体形成夹心，为非竞争分析方式；或者使用标记的抗独特型(anti-idiotypic)抗体，结合於未占据位点，为竞争性分析方式。也可以做捕捉抗体与显示抗体的双重标记，反应后计算两者比率得出结合位点占有率。标记物可使用放射性同位素、酶、发光物质等，若使用荧光标记，可以用共聚焦显微镜对点阵进行扫描，从而得出各斑点的抗体结合位点占据率，以及被测物质的量。本方法可以得到很高的灵敏度，正在进行的实验可以测出在一百个平方微米上的一个标记抗体分子(即S^*_min＝0.01分子/μ)，称为标记抗体密度的检出下限，以S^*_min表示，从理论上测算^［2］，S^*_min＝0.01分子/μ时的