牙体牙髓牙周病学杂志2000年第10卷第4期

陆群郭敬俊吴补领宋俊峰

摘要目的：探讨胶质源性神经营养因子(GDNF)在牙髓炎症中的表达变化及意义。方法：应用免疫组织化学方法比较正常和炎症状态下，GDNF在牙髓组织中的变化。结果：正常牙髓组织GDNF染色呈阴性，炎性牙髓组织染色GDNF呈阳性，其主要分布在牙髓组织成牙本质细胞和成牙本质细胞深层细胞，而牙髓神经雪旺氏细胞染色为阴性。结论：GDNF参与牙髓炎性反应，与炎性牙髓组织再生发芽有关。

关键词：胶质源性神经营养因子；神经生长；免疫组化

胶质源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)，是一种新发现的神经营养因子，为TGF-β家族成员之一。其促神经再生作用较NGF强^［1］，对牙胚神经组织的发育形成起促生长作用，在牙髓神经发育形成过程中起重要的促生长作用^［2］。本实验旨在观察大鼠牙髓炎症状态下和正常状态下G dNF在牙髓组织中的变化，并作对比性研究，利用免疫组织化学染色直观再现GDNF在参与牙髓炎症时的表达部位，探讨其对牙神经再生修复的作用和意义。

1材料和方法

1.1牙髓炎动物模型建立

SD大鼠24只，雌性，体重200～240g，其中4只做正常对照，余20只用846药液（解放军农牧大学军事长春兽医研究所)0.5ml/kg注射鼠股外侧肌群，待10min后鼠完全麻醉，于右侧上、下颌第一磨牙牙合面穿髓，用5g/L 浓度的γ-内毒素(sigma，USA)作用于穿髓点15min后，玻璃离子水门汀封闭，建立牙髓炎动物模型，实验分5组，炎症3、6、9、12、15d组^［3］。

1.2样本制备

用30g/L戊巴比妥钠腹腔深度麻醉后开胸，经升主动脉灌注生理盐水100～150ml，换含40g/L多聚甲醛液的0.1mol/L磷酸缓冲液350～450ml灌注固定1h,取带有完整牙齿的上、下颌骨。标本浸入40g/L多聚甲醛液后固定2～4h，放入Krinstensen's脱钙液脱钙7d，浸蜡包埋，石蜡切片，片厚15μm。

1.3免疫组织化学染色

标本切片经脱蜡至水，PBS(pH=7.4)振洗， 30ml/L过氧化氢液封闭内源性过氧化物酶10min， 室温。加入GDNF抗体1：25（北京中山生物技术公司，），4℃孵育24 h；加入生物素化二 抗,37℃,孵育 1h；加入复合物；DAB镜下控制显色，自来水终止反应。系列乙醇脱水，二甲苯透明，DPX胶封片。显微镜下观察并照相。本实验中用生理盐水代替一抗作为空白对照组。

2结果

空白对照组、正常对照组标本染色为阴性。炎症3d组切片组化染色为弱阳性(图1)。炎症6、9、12、15d各组GDNF在成牙本质上染色呈不同程度的阳性反应，显微镜下观察，炎症坏死区残留的成牙本质细胞和成牙本质深层细胞胞浆着色，为黄褐色，牙髓成纤维细胞染色阴性，牙髓神经雪旺氏细胞染色也为阴性(图2)。除3d组外，各组GDNF在成牙本质细胞上阳性染色深浅差异不显著。

图1牙髓炎症3d组GDNF于成牙本质细胞(OD)染色阳性，成纤维细胞(FB) 染色阴性(×100)

图2牙髓炎症12d组GDNF于成牙本质细胞(OD)染色阳性，成牙本质深层(SB)染色阳性，神经 雪旺氏细胞(SC)染色阴性(×100)

3讨论

GDNF是从胶质细胞瘤(B49)中发现并克隆成功的，故称之为胶质源性神经营养因子。研究发现GDNF不仅存在于中枢神经系统纹状体黑质，也存在于外周神经系统靶器官，如发育中的牙齿、 内耳、眼、舌乳头、嗅上皮，对感觉神经有营养活性^［4，5］。目前普遍认为GDNF是通过与G DNF-α和C-Ret两种受体结合形成GDNF-GFRα-cRet复合体，激活 c- Ret酪氨酸蛋白激 酶活性，导致一系列底物蛋白的磷酸化反应，而发挥GDNF的生物活性效应^［6，7］。

牙齿发育过程包括了上皮与间充质细胞间的作用，及细胞外基质成分之间的相互作用，有多种生长因子参与此复杂过程，神经营养因子在其中发挥不可忽视的作用。大部分牙髓细胞来源于神经嵴，并与神经细胞有共同特性：相同的膜电位，有对神经营养因子、生长相关蛋白GAP-43、胶质酸纤维蛋白(glial acidic fibrillary protein)等与神经细胞类似的应答反应。神经营养因子家族成员NGF被确认为积极参与牙髓神经发育和牙齿硬组织形成过程。而GNDF是一种新发现的神经营养因子。

当釉质牙本质基质矿化完全，牙冠外形基本形成时，三叉神经组织分化生长并伸入至髓腔^［8］，神经纤维伴随血管进入髓腔。原位杂交技术研究表明，大鼠牙髓神经发育在胚胎15d至生后7d（E15-P7），GDNF于三叉神经节处有一过性高表达^［9］，在 牙胚发育E12-P7期于牙蕾(tooth germ)周边间充质有表达，牙蕾是诱导牙髓神经发育形成的重要细胞凝聚区。提示GDNF参与牙髓神经的发育及分化，对牙髓神经生长起重要的促生长作用^［10］。 随着神经组织发育成熟，GDNF在三叉神经节及牙髓组织表达量锐减，使用原位杂交技术难以检测出阳性信号。但也有报道成年鼠纹状体和尾侧亚核中枢神经存在低水平表达，提示其基因表达在神经发育的某一特定阶段开放，对神经发育与分化起调控作用，在神经发育成熟后，只有在靶细胞区才表达，以便维持支配神经末稍的生存^［11］。

本实验以γ-内毒素刺激牙髓组织所建立的大鼠慢性牙髓炎模型，有牙髓存活时间长、牙髓组织有足够时间展示炎症渗出期、坏死期、修复期的不同反应阶段的特点。运用免疫组化技术观察到GDNF在炎性牙髓组织的成牙本质细胞及成牙本质深层细胞表达，其意义可能使炎症坏死区残存的神经纤维向成牙本质和牙髓组织方向延伸。目前有研究表明，牙髓炎症后期神经末稍增多、增长^［12，9］，神经末稍发芽可能与牙髓炎症损伤时GDNF在成牙本质细胞及成牙本质深层细胞表达增多有关。增生神经末稍大多为SP、CGRP阳性纤维，SP、CGRP一方面为血管扩张剂，使牙髓腔内压力持续升高，加重牙齿疼痛，同时又为疼痛传导递质，也可引起炎性牙痛。

炎症组织的修复过程在很大程度上可看作是组织发育过程的重复^［13］。本实验以正常牙 髓组织为对照，观察GDNF在成牙本质细胞及深层成牙本质细胞染色阳性，正常对照组成牙本质 细胞染色呈阴性，此结果与GDNF在牙胚中表达强而成熟牙齿中表达变弱的现象一致。

GDNF在牙髓纤维细胞和牙髓神经末稍雪旺氏细胞染色阴性，提示炎症导致GDNF在成牙本 质细胞处变化可能先于牙髓神经末稍。炎症损伤时GDNF首先在牙髓组织的成牙本质细胞及成牙本质深层细胞表达，并促进炎症坏死区残存的神经纤维向成牙本质和牙髓组织方向生长，之后出现炎症后期神经末稍发芽，其相互作用机制尚需进一步研究。

陆群(第四军医大学口腔医学院)

郭敬俊(第四军医大学口腔医学院)

吴补领(第四军医大学口腔医学院)

宋俊峰(神经生物教研室陕西西安710032)

参考文献：

［1］Nosrat CA,Hoffer bJ.Cellular and developmental patterns of expression of Ret and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha mRNAs［J］.Exp Brain res.1997,115:410

［2］Buj BA,Buchnan VL.GDNF in an age-specific survival factor for sensory and autonomic neurons［J］.Neuron,1995,15:821

［3］侯本祥，史俊南，丰泽浯,等.内毒素脂多糖刺激大鼠牙髓组织病理学反应［J］.牙体牙髓牙周病学杂志,1997,7(1)：12

［4］宋俊峰，鞠躬.GDNF在大鼠神经系统发育分化中的基因表达分布与变化及人GDNF基因克隆与表达：［学位论文］［D］.西安：第四军医大学,1997

［5］Lin LF,Doherty DH,Lile JD.GDNF:a glial cell line-derived neuro trophic factor for midbrain dopaminergic neurons［J］.Science,1993,260(5111):1130

［6］Lindsay RM,Yancopoulos GD.GDNF in bind with know orphan:accens sory implicated in new twist［J］.Neuron,1996,17:572

［7］Mason I.The GDNF receptor:recent progress and unanswered questions［J］.Mol cell Neurosci,1996,8:112

［8］吴奇光，杨连甲.口腔组织病理学［M］.北京:人民卫生出版社,1993

［9］Luukko K,Suvanto P,Saarma M.Expression of GDNF and its receptor in developing tooth is developmentally regulated and suggests multiple roles in innervation and organogenesis［J］.Dev Dyn,1997,210:463

［10］Nosra