细胞与分子免疫学杂志2000年第16卷第4期

陈伟薛采芳甄荣芬樊荣

摘要：目的研究TK基因在真核细胞中的表达。方法应用已构建和表达的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-1TK)融合蛋白免疫兔制备抗HSV-1TK血清，并以免疫印迹法鉴定其特异性，以免疫荧光法检测HSV-1TK基因在转染人肝癌细胞系中的表达。结果免疫印迹显示，自制和国外提供的抗TK兔血清，均能特异性地识别M_r约为97000的TK融合蛋白。免疫荧光染色得到的结果满意，而且自制抗血清的效价和染色强度均优于国外提供的免疫血清。结论原核表达的HSV-1TK融合蛋白具有较好的免疫学活性；自制抗HSV-1TK兔免疫血清可为进一步研究TK基因在真核细胞中的表达及用于治疗提供了一种有用的试剂。

关键词：单纯疱疹病毒；胸苷激酶；基因治疗；基因表达；多克隆抗体

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-1TK)基因，属于药物敏感基因(drugsensitivegene)，又称为“自杀”基因(suicidegene)。其所编码的TK能使一些对真核细胞无毒或低毒的药物前体(pro-drug)，如核苷类似物无环鸟苷(acyclovir,ACV)和丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)等磷酸化，形成细胞代谢的毒性产物，明显地抑制DNA合成使细胞死亡。这种药物敏感基因疗法，又称为病毒介导的酶/药物前体疗法(virus-directdenzyme/prodrugtherapy,VDEPT)。体内外实验均证明，HSV-1TK基因治疗系统具有“旁路效应”(bystandereffect)^〔1〕，能大大地增强该系统的杀瘤效率。目前，这种疗法已应用于多种恶性肿瘤的体外、前临床和临床治疗方案中，其中HSV-1TK/GCV系统在人体内治疗恶性脑胶质瘤的疗效受到了高度评价^〔2〕。

由于真核细胞基因表达调控机制的复杂性和某些未知因素的影响，即使已证实HSV-1TK基因转移的细胞内存在着TK基因，也可能出现低表达或不表达的情况，而导致TK基因治疗效果下降，甚至无效^〔3〕。因此，从蛋白质水平分析其表达显得更为重要。由于目前尚无抗HSV-1TK免疫血清和mAb出售，给观察和研究TK基因在真核细胞中的表达带来一定困难，因而只能根据功能性杀伤实验间接判定TK的表达。但此种方法费时、缺乏直观性。

本研究拟用已构建和表达的HSV-1TK融合蛋白免疫兔制备抗HSV-1TK血清，并对其特异性进行初步鉴定。另外，应用该血清进行了免疫荧光染色，以观察已转染细胞内TK基因的表达情况，为进一步研究TK基因在真核细胞中的表达奠定基础。

1材料和方法

1.1材料HSV-TK基因长期稳定转染的人肝癌细胞系HHCC/TK，由本室建立^〔4〕。

1.2方法

1.2.1诱导表达及其产物的粗提重组质粒pWR450-1/TK由本室构建^〔5〕,为含有HSV-1TK基因全长cDNA序列的融合表达载体pWR450-1/TK/JM109。经IPTG诱导可表达相对分子质量(Mr)约为97000的TK与β-半乳糖苷酶(Mr为55000)的融合蛋白。将诱导菌液离心集菌,取沉淀加入缓冲液〔100ml/L甘油，1mmol/LDTT，40mmol/LKCl，1mmol/LEDTA及1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)〕，反复冻融3次,再于冰浴中超声粉碎，然后离心取上清液(即为TK融合蛋白粗提物)，用紫外分光光度计定量蛋白质，于-20℃冻存备用。

1.2.2兔抗HSV-1TK血清的制备将TK融合蛋白粗提物进行SDS-PAGE，染色后，切下Mr约为97000的条带，研磨，加入生理盐水制成浓度约为1g/L的TK融合蛋白悬液，采用背部皮下多点注射免疫法，免疫家兔5次，各间隔1个月，每次剂量约为2mg/只兔。首次加等量弗氏完全佐剂(Gibco/BRL公司产品)，第2～4次加等量弗氏不完全佐剂(Gibco/BRL公司产品)，末次免疫不加佐剂，剂量为1mg/只兔。末次加强免疫后7d，放血分离血清。

1.2.3兔抗HSV-1TK血清的Westernblot分析

主要步骤如下:取HSV-1TK融合蛋白粗提物进行SDS-PAGE，常规转印(剪成宽为0.5cm纸条)后，以2g/L丽春红S染色;或以1g/L脱脂奶粉封闭、洗涤，依次加入以1g/L脱脂奶粉稀释的哈佛医学院赠送和自制兔抗HSV-1TK血清及正常兔血清，再加入1g/L脱脂奶粉稀释的HRP-SPA(1∶200，本室制备)(两步间均做洗涤)，最后将NC条置DAB溶液中显色，并以纯水漂洗中止显色。

1.2.4HSV-1TK基因的表达采用细胞免疫荧光进行检测，具体步骤是：(1)制备细胞点片：将胰酶消化、生长良好的HHCC和HHCC/TK细胞(浓度为10⁸个/L)，点于无菌镀膜片上(10μL/孔)，置于湿盒内(37℃，5％CO₂)培养12h，再用预冷丙酮4℃固定30min，洗涤、吹干，置-20℃干燥保存。(2)免疫荧光染色主要步骤：以0.01mol/LPBS-Tween20洗涤细胞生长片(1×5min)，吹干，加入国外提供和自制抗HSV-1TK兔血清或正常兔血清，4℃湿盒内过夜(18h)，加FITC-Ig(1∶100，Sigma公司产品)，于37℃湿盒内作用45min后镜检。

2结果

2.1兔抗HSV-1TK血清的Westernblot分析自制的(1∶20，1∶40)及国外提供的(1∶10)抗HSV-1TK兔血清均能识别Mr约为97000的TK融合蛋白且染色较强，但尚有其它一些菌体成分也略着色，正常兔血清(1∶40)也可染出1条Mr∨97000的弱色带，结果见图1。

图1抗HSV-1TK兔血清的Westernblot分析

Fig1 The Western blot analysis of the rabbit anti-HSV-1TK serum

1:Low molecular protein marker;

2:pWR450-1/TK/JM10⁹induced by IPTG(stained with ponceau S)；

3:Self-madeanti HSV-1TK rabbit serum(1:40)；

4:Self-madeanti HSV-1TK rabbit serum(1:20)；

5:Rabbit antiHSV-1TK serum provided abroad(1:10)；

6:Normal rabbit serum(1:40).

2.2HSV-1TK基因的表达用两种抗HSV-1TK兔血清做免疫荧光染色，结果显示，经G418选择、克隆化和亚克隆化的HHCC/TK细胞系全部呈阳性反应；亲代细胞HHCC呈阴性反应(图2、3)。两种抗血清的染色特征极为相似，即均为胞浆内均匀着色(荧光较强),并散布着一些较粗大的颗粒。

图2自制抗HSV-1TK兔血清(1:50)对HHCC/TK细胞的

反应性(×400)

Fig2 Reactivity of self-made anti-HSV-1TK rabbit serum(1:50)

to HHCC/TK cells(×400)

图3国外提供的抗HSV-1TK兔血清(1:10)对HHCC/TK

细胞的荧光染色(×400)

Fig3 Reactivity of anti-HSV-1TK rabbit serum(1:10)provided

abroad to HHCC/TK cells by immunofluorescence stain-

ing(×400)

3讨论

随着HSV-1TK基因系统治疗恶性肿瘤研究的不断深入，一些学者也在从事其基因结构与功能的关系、突变体与高效胸苷激酶筛选等方面的探索，并取得一些进展。目前，HSV-1TK基因全长序列已经清楚^〔6，7〕。有文献报道，在大肠杆菌中可表达出具有生物学活性的TK，并研究了不同的转录调节序列(如启动子等)对表达的调控作用^〔8-11〕。另外，应用随机序列突变技术，已筛选出对ACV和GCV均敏感的高效HSV-1TK^〔12〕。研究HSV-1TK原核表达产物的免疫学活性及TK基因在真核细胞中的表达，较为简便、快速的方法是，采用抗HSV-1TK免疫血清或mAb进行免疫学检测。但由于目前尚无抗HSV-1TK血清或mAb出售，给观察和研究HSV-1TK基因在转染真核细胞中的表达带来一定困难。虽可通过鉴定转染细胞基因组DNA和RNA来证实TK基因的存在，但由于真核细胞中基因表达调控机制的复杂性和一些未知因素影响，即使已证实TK基因确实存在，也可能出现低表达或不表达的情况，而导致TK基因治疗效果的降低，甚至无效。因此，从蛋白质水平上分析其表达(即用抗HSV-1TK抗体检测转染细胞中TK的表达)，则显得更为重要。本研究从大肠杆菌中成功地表达出具有免疫学活性的HSV-1TK融合蛋白,并以免疫兔制备了抗HSV-1TK血清。Westernblot分析表明，自制和国外提供的抗HSV-1TK兔血清均能特异性地识别Mr约为97000TK融合蛋白，且自制抗血清工作浓度为1:40时，染色性仍良好。但一些菌体成分和正常兔血清，亦可与抗TK兔血清(国外和自制)产生微弱染色，是否因免疫原不纯以及正常兔血清中含有抗大肠杆菌成分的抗体等所致，尚待进一步研究确定。

本文应用该抗TK兔血清做免疫荧光染色，检测HSV-1TK基因在转染细胞中的表达，得到较满意的结果,且自制抗血清的效价和染色强度均优于国外的免疫血清。鉴于目<