军事医学科学院院刊2000年第24卷第2期

钟辉曹诚李平张艳红时运林马清钧

摘要目的：研究以霍乱毒素B亚基（CTB）为载体的重组疟疾多价抗原（AWTE）表位的DNA疫苗在恒河猴中的免疫原性及对相应疟原虫感染的免疫保护作用。方法：以恒河猴为模型，肌肉途径免疫编码CTB-AWTE基因的质粒，免疫间隔为15 d，免疫3次，免疫剂量为每种质粒每次500 μg/只。结果：DNA疫苗组免疫2次后即产生了较高水平的细胞免疫和体液免疫，免疫后91 d用1.25×10⁸个猴疟原虫攻击，对照组5只动物在攻击后14 d左右全部感染，感染持续34 d以上；DNA疫苗组的5只动物在攻击后60 d没有感染。结论：这种鸡尾酒式的抗原表位组合构建的DNA疫苗具有很好的免疫原性,同时也说明DNA疫苗在抗疟感染中起着举足轻重的作用。

关键词：DNA疫苗；恒河猴；霍乱毒素B亚基；疟疾；猴疟原虫

为了有效地预防和控制疟疾，人们非常重视疟疾疫苗的研制，但由于疟原虫的生活史极为复杂，其抗原性弱且有很强的抗原变异性，使得疟疾疫苗的研究工作进展缓慢。近年来，随着分子生物学技术的发展，对疟原虫抗原及免疫保护作用的研究日益深入，出现了以Spf66为代表的疫苗应用于临床试验，但其免疫效果不肯定^［1］。由于疟原虫自然感染后未见明显的保护，因此，我们认为要研制有效的疟疾疫苗就必需寻找有效的免疫增强途径，提高机体对抗原的免疫应答水平。为此，我们选用了恶性疟原虫红内期裂殖子T、B细胞表位及红外期子孢子表面T、B细胞表位组成的合成多抗原表位抗原基因AWTE，由Spf66、(NKNDD)₈及CSTE组成；依据霍乱毒素B亚基(CTB)无毒性、免疫原性强、刺激产生粘膜IgA和血清IgG抗体、加强抗原表位的抗原性等特点，选用B亚单位基因作为佐剂。

由于恶性疟除人体外，仅能感染哥伦比亚的夜猴属（Aotus）,其供应极为有限，给疫苗效果的初步评价带来很大困难。近年的研究表明，恶性疟子孢子抗原（CSP）免疫小鼠后，对约氏疟原虫（P.yoelli）子孢子的攻击有交叉免疫保护作用^［2］;猴食触疟原虫(P.cynomolgi)也被用作人间日疟原虫(P.vivax)疫苗研究的模型^［3］，由于本研究应用的抗原（AWTE）含有子孢子抗原（CSP）及在恶性疟及间日疟间有免疫交叉保护作用的表位NKNDD,因此选用恒河猴用作评价该候选疫苗的动物模型。

1材料与方法

1.1重组质粒

质粒pCMV-S由美国宾夕法尼亚大学王宾教授惠赠。重组质粒pCMV-AWTE、pCMV-IL-2由本室钟辉等构建^［4］。

1.2实验动物及攻击用虫株

恒河猴，体重2～3.5 kg，购自军事医学科学院实验动物中心，使用前均经镜检证实没有疟原虫感染。猴疟原虫由军事医学科学院微生物学流行病学研究所时运林教授提供。

1.3猴疟原虫的攻击实验

从液氮中取出的冷冻虫种接种2只健康正常猴，转种的2只猴一般到第9～13天时（配子体密度一般较高）让斯氏按蚊叮咬血餐，感染蚊虫饲养在26℃的养蚊室。从感染良好的斯氏按蚊获取猴疟原虫子孢子，用生理盐水配成6.25×10⁷个/ml,第三次免疫后63 d每猴后腿静脉接种子孢子悬液2 ml。

1.4抗体的测定

1.4.1ELISA方法测定抗CT-B抗体应用提纯的CTB亚单位500 ng在碳酸盐缓冲液中(pH9.6)包被酶联板，4℃过夜，用3%的BSA于37℃封闭2 h，加入每孔100 μl经适当稀释的恒河猴待检血清，37℃孵育1 h，用PBST溶液清洗4次后，加入蛋白质A-HRP，37℃孵育30 min，洗涤后OPD显色，于酶标仪读D₄₉₂数值^［4］。

1.4.2IFAT方法测定抗AWTE抗体体外培养的疟原虫裂殖子，涂薄血片，丙酮固定10 min，加入不同稀释度的待测抗体，室温于湿盒中孵育30 min。加入荧光标记的第二抗体，避光湿盒中室温放置30 min，甘油封片，荧光显微镜镜检。根据荧光的强度来判定血清中抗体的滴度^［5］。

1.5细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测

1.5.1刺激细胞的制备从对照的外周血中分离淋巴细胞，调整细胞浓度至2.5×10⁶个/ml，加入1～10μmol/L(5～50 μg)的相关肽（人工合成的AWTE抗原中T细胞表位的一段多肽，溶在含2μg/ml ConA的R1640中），于37℃、5%CO₂孵箱中保温4 h。阴性对照采用不相关抗原刺激。离心细胞后，悬于含丝裂霉素50μg/ml 的PBS中，于孵箱中37℃放置1 h，用PBS洗涤细胞4次，以除掉丝裂霉素。

1.5.2效应细胞的制备免疫的不同时期分离外周血淋巴细胞，将每组的5只恒河猴分离的淋巴细胞混合，调整细胞浓度至30×10⁶个/ml，于37℃、5%CO₂孵箱中与2.5×10⁶个/ml的刺激细胞作用4～6 d。

1.5.3靶细胞的制备实验前24 h将从恒河猴外周血分离的B淋巴细胞用含15%小牛血清的1640全培养液调整细胞浓度至3×10⁶个/ml，加入10μmol/L相关肽于37℃、5%CO₂孵箱中作用90 min,用培养基洗3次。

1.5.4LDH基质液配制0.2 μmol/L Tris-HCl(pH 8.2)缓冲液含50 mmol/L的L(+)乳酸钠，0.60 mmol/L的INT，0.30 mmol/L的PMS及1.5 mmol/L的NAD。

1.5.5CTL细胞活性的检测96微孔板上划分好样品、自然释放及最大释放孔，根据不同的效靶比（E/T）将所有不足体积的孔补充至200μl，每孔至少做3个平行。在37℃、5%CO₂孵箱中培养20～24 h后，取100 μl上清加到另一微孔板中，立即用酶联仪在波长490 nm下测吸光度，每隔1 min记录一次D值。计算每一孔的平均每分钟D值的变化，按如下公式计算CTL活性：

(S-N)/(M-N)

S为样品释放值，M为最大释放值，N为自然释放值。

1.6免疫方案

免疫间隔为15 d，免疫3次，免疫剂量为每种质粒每次500 μg/只，每7 d采血一次。

1.7猴疟原虫攻击后的保护性实验

接种疟原虫第7天开始，每天采耳血厚血膜，Giemsa染色后血检，连续观察68 d，记录其阳性出虫时间和原虫血症的消长情况。

2结果

我们以CTB-AWTE融合蛋白免疫小鼠后，对约氏疟原虫子孢子攻击的保护率在50%左右，用其相应的质粒pCMV-CTB-AWTE与pCMV-IL-2免疫小鼠，它们都诱导机体产生了体液免疫和细胞免疫，免疫的小鼠进行疟原虫子孢子攻击实验，保护率为60%～80%。根据文献报道，灵长类动物通过肌肉直接注射DNA产生相关抗原蛋白的能力非常有限，这可能会限制这项技术在开发人类疫苗方面的应用。为了检验我们所构建的这种疫苗在灵长类动物中产生免疫反应的能力以及其保护作用，我们以10只恒河猴为动物模型进行疟疾疫苗的评估，共分2组，每组5只，免疫3次，每次间隔15 d。恒河猴分组如下：

(Ⅰ)对照组：空质粒pCMV-s免疫,1～5号。

(Ⅱ)DNA疫苗免疫组：pCMV-IL-2与pCMV-CTB-AWTE混合质粒肌肉注射免疫恒河猴，每种质粒500μg/只，6～10号。

2.1免疫原性

2.1.1体液免疫

2.1.1.1IFAT检测AWTE抗体。第三次免疫后7 d的恒河猴血清，按1∶100，1∶1 000，1∶1 500和1∶2 000稀释，用间接免疫荧光法测定抗AWTE抗体滴度。结果发现，免疫组的5只恒河猴均产生了抗AWTE抗体，抗体水平为1∶1000。

2.1.1.2ELISA检测CTB抗体。每次免疫后7 d采血，ELISA检测血清中抗CTB抗体的滴度，结果见图1。

图1免疫后不同时间的抗CTB抗体滴度

由图1可以看出，DNA疫苗免疫组的5只恒河猴免疫后抗体个体差异较大，在第一次免疫注射后15 d检测到抗CTB抗体，第二次免疫注射后7 d抗体滴度显著升高，最高滴度可达1∶25600，第三次免疫注射后抗体滴度无明显变化，35 d后抗体滴度明显下降，攻击后21 d抗体滴度有明显升高。

以上结果表明，我们构建的恶性疟原虫抗原基因的DNA疫苗在以恒河猴为动物模型的免疫实验中诱导机体产生了较高滴度的抗CTB抗体以及抗AWTE抗体，说明CTB-AWTE这种组合没有改变AWTE的免疫原性。2.1.2细胞免疫

免疫3次不同时间从猴血中分离单核细胞，用LDH方法检测CTL活性，结果见图2。

图2免疫后恒河猴的CTL活性比较

由图2可以看出，DNA疫苗免疫组猴全部产生了特异性的细胞毒淋巴细胞活性，与抗体变化不同的是，第一次免疫后没有产生特异性的CTL活性，第三次免疫后15 d的CTL活性要高于第二次