军事医学科学院院刊2000年第24卷第3期

程芳李淑琴舒东张兆山曹勇

摘要目的：产肠毒素大肠杆菌产生的不耐热肠毒素（LT）不仅是很强的口服免疫原，而且其粘膜免疫佐剂作用显著。LT的毒性限制了它的直接使用，希望通过体外定点诱变技术，获得具有粘膜免疫佐剂作用的LT减毒株。方法：以人源LT基因为研究对象，首先构建了重组质粒pUC19-LT，然后用单引物PCR法和重叠延伸PCR法分别构建了LT q7和K63基因突变体。结果：CHO细胞体外试验和家兔肠结扎体内试验毒性测定的结果表明，LT突变体K63的毒性明显降低。结论：K63有希望成为候选的高效粘膜免疫佐剂。

关键词：大肠杆菌；不耐热肠毒素；定点诱变；突变体

不耐热肠毒素（LT）是由毒素源性大肠杆菌产生的，它是引起人及哺乳动物腹泻的主要因素之一。LT由一个A亚基（LT-A）和5个B亚基（LT-B）组成， lT-A具有ADP-核糖基化转移酶活性，可以引发毒素效应；LT-B具有与宿主细胞表面的神经节苷脂GM1结合的功能^［1］。不耐热肠毒素不仅是很强的口服免疫原，而且具有显著增强宿主特异免疫应答的粘膜免疫佐剂作用^［2,3］。由于LT自身的毒性，使其作为粘膜免疫佐剂的使用受到限制。因此，期望通过基因工程手段得到一系列LT突变体，使其毒性降低的同时，仍保留其粘膜免疫佐剂的属性。本研究根据计算机模拟LT空间构型的结果，在LT-A上选择了与ADP-核糖基化转移酶活性密切相关的两个位点，构建了突变体Q7（将LT-A第7位的精氨酸突变为谷氨酰胺）和K63（将LT-A第63位的丝氨酸突变为赖氨酸）。毒性实验证明突变体K63的减毒效果显著，可以作为临床上使用的候选粘膜免疫佐剂。

1材料和方法

1.1菌株和质粒

E.coli H10407（CFA／Ⅰ， ST⁺LT⁺）和E.coli jM109为本研究室贮存菌株。E.coli E44815(CFA/Ⅱ,ST⁺LT⁺)购自中国药品生物制品检定所。质粒pUC19和pGEM-T购自Promega公司。

1.2限制性内切酶及连接酶

分别购自New England Biolabs公司、Promega公司和华美生物工程公司。

1.3DNA操作

参照文献［4］。

1.4PCR致突变法

参照文献［5］。

1.5GM1酶联免疫吸附实验（GM1-ELISA）

LT-B抗血清购自上海卫生防疫站，LT-B抗原的测定参照文献［6］。

1.6亲和层析纯化

亲和层析柱填料为CNBr活化的Sepharose 4B, CTB抗血清由本所刘传暄教授提供，按厂家推荐的条件制备亲和层析柱，进行亲和层析纯化。

1.7SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

参照文献［4］。

1.8CHO细胞测定突变体的毒性（MTT法）

将待测样品在96孔板上做倍比稀释，加入经胰酶消化的CHO细胞（10⁵细胞/ml）100μl，CO₂恒温箱中培养48 h后加入 5 mg／ml的 MTT 20 μl,37℃放置4 h，加入100 μl二甲基亚砜显色，在490 nm处测定光吸收值。

1.9家兔肠结扎实验

实验前大耳白家兔（2.5 kg）禁食48 h。手术前待测样品用除菌滤器过滤。剖腹取出小肠，结扎时每节肠段注入1 ml滤液，缝合后仍将家兔放回兔笼，可供水，但仍禁食。18 h后观察每节肠段的性状。

2结果

2.1LT重组质粒的构建

用碱变性裂解和氯化铯超速离心的方法从野生型E.coli h40107分离含有LT基因的野生大质粒pJYll。用引物1（5′-GGGGATCCCATCATTGACA-

tCATGTTGC-3′）和引物2（5′-CGCTGCAGCTAGTTTTCCATACTGATTG-3′）扩增出1203 bp的LT基因，克隆入pUC19载体，构建了重组质粒pUC19-LT（图1）。限制性酶切鉴定正确。

2.2突变体Q7的构建

选用不对称 PCR改良的单引物法（图2）。引物1和引物 4（5′-CTGGGGGGTCTAGAGTCAGC-

cTTGTATAA-3′）经不对称PCR扩增出 188 bp的单链，用它和引物2可扩增出带有点突变的LT基因。测序结果表明，LT-A第7位氨基酸的编码序列由CGT突变为CAG，将精氨酸（Arg）突变为谷氨酰胺（Gln）。

图1重组质粒pUC19-LT的构建示意图

图2突变体Q7重组质粒的构建示意图

2.3突变体K63的构建

选用重叠延伸PCR法。第一次PCR以pUC19-LT为模板，用引物1和6(5′-CTAAGCTTAGTTT-

tGAGAAGTGCTC-3′)，引物3(5′-CGGGGTACCTAGTTTTCCATACTGATTG-3′）和引物5（5′-GC-

aCTTCTCAAACTAAGCTTAGA-3′）扩增出片段Ⅰ和Ⅱ，回收纯化，再以片段Ⅰ、Ⅱ作模板，用引物1和引物3扩增带有目的突变的LT基因，与质粒pGEM-T体外进行重组（图3）。限制性酶切鉴定正确（图略）。核苷酸序列分析结果证明引入了TCT→AAG的突变，将LT-A第63位的丝氨酸（Ser）突变为赖氨酸（Lys）。

图3重叠延伸PCR构建突变体K63重组质粒

2.4LT重组质粒及突变体表达产物的检测

GM1-ELISA是根据LTB与神经节苷脂GM1特异性结合的原理而设计的，它是检测LT表达的有效方法之一。以LT⁺的野生株E.coli h10407和E44815为阳性对照，以E.coli JM109和DH5α为阴性对照，结果显示LT重组质粒及突变体均能表达LT。这是由于克隆的这段LT基因带有自身的启动子及翻译起始序列；突变体的突变位点均发生在有毒性的LT-A上，对LT-B及其抗原性没有影响。SDS-PAGE的结果证实了突变体表达产物中LT-A的存在（图4）。

图4LT及其突变体的蛋白凝胶电泳

1.突变体K63; 2.突变体Q7;3.重组LT;

4.相对分子质量标准 (Promega)

2.5毒性检测

CHO细胞对LT的毒性非常敏感。在CHO细胞体外实验中，以生长在细胞培养液中的CHO细胞为阳性对照，培养48 h后，正常的贴壁细胞呈梭形，吸收了毒素的细胞变为圆形。在细胞培养液中当加入0.1 ng/ml纯化的LT或LT Q7突变体时，绝大多数细胞形态变圆，说明Q7的毒性仍然很强；而加入纯化的1μg／ml K63时仍未检出生物毒性，其毒性为野生型的10^-4。MTT法测定样品在D₄₉₀的光吸收，绘制的曲线表明突变体K63减毒效果非常明显（图5）。家兔肠结扎实验中，用表达全毒素的大肠杆菌JM109(pUC19-LT)作阳性对照，阴性对照为只表达LT的B亚基的JM109(pSF2.2)。检测结果表明，注射了JM109 (pUC19-LT)和JM109(pUC19-Q7)的肠段充血肿胀，而注射了JM109(pGEMT-K63)的肠段正常无异状，突变体K63的减毒效果在生物体内也得到了证实（图略）。

图5MTT法测定突变体的毒性

3讨论

LT粘膜免疫佐剂作用的发现为粘膜免疫的研究提供了新视野^［7～9］。出于安全性的考虑，LT不能直接作为疫苗使用。LT的毒性是由NAD⁺依赖的ADP的核糖基化反应引起的。计算机模拟LT空间构型的结果显示，与ADP-核糖基化转移酶活性相关的氨基酸残基在空间上聚集呈球状，其中有一空穴是NAD蛋白的结合位点^［10］。Arg-7可以与“穴”入口处的几个氨基酸形成氢键，氢键断裂后NAD蛋白可以结合在ADP上。用Gln取代Arg后，氢键的形成和断裂没有受到太大影响，因而突变体Q7仍具有生物毒性。Ser-63位于“穴”的底部，Lys取代Ser后，引入了一个更大并且带有支链的氨基酸，占据了NAD的结合位点，Lys还与Gln-110和Gln-112形成稳定的二硫键，故突变体K63无毒且能够保持LT的完整构型。此外，用CHO细胞作毒性检测时，K63突变体的毒性为野生型的10^-4。由于Y1细胞对LT的敏感性更高，用Y1细胞作实验可能会检测到更高的减毒效果^［11］。

［基金项目］国家“八六三”高技术基金资助项目(863-102-07-03-05)

［作者简介］程芳(1973-)，女，河南郑<