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摘要目的：研究神经细胞粘附分子（NCAM）在人脑星形细胞瘤发生发展中的作用。方法：用原位杂交和免疫组织化学方法检测40例人脑星形细胞瘤组织中的NCAM mRNA及其蛋白（CD56）的表达。结果：星形细胞瘤1，2级中NCAM mRNA及其蛋白的表达显著高于星形细胞瘤3，4级，核酸与蛋白水平的检测结论一致。结论：NCAM mRNA及其蛋白的表达与星形细胞瘤的恶性程度有关， NCAM的高表达可能与星形细胞瘤的侵袭转移有关，并有可能成为星形细胞瘤恶性程度、侵袭能力的判别指标，为术后继续治疗提供依据。
关键词：神经细胞粘附分子；星形细胞瘤；原位杂交
神经细胞粘附分子(NCAM)作为一种细胞粘附分子，介导细胞粘附，参与神经生长与突触再建，及多种神经疾病的病理发生过程。本研究应用原位杂交和免疫组织化学方法检测了人脑星形细胞瘤组织中的NCAM mRNA及其编码蛋白（CD56）的表达，探讨其在人脑星形细胞瘤发生发展中的作用。
1材料和方法
1.1组织标本收集我科1999年1～12月人脑星形胶质细胞瘤新鲜手术标本40例，其中男性25例，女性15例，年龄为5～67岁。正常人脑组织3例、人脑膜瘤3例，所有标本均经常规病理检查证实，星形细胞瘤按Kernohan分类法分类，Ⅰ，Ⅱ级21例，Ⅲ，Ⅳ级19例。标本制成冰冻切片与石蜡切片，分别用于原位杂交与免疫组织化学检测。
1.2方法
1.2.1原位杂交NCAM-140 cDNA质粒由Kruse博士惠赠, 以KpnⅠ与BamHⅠ双酶切得到633 bp片段，将其亚克隆于PSPT19载体上，应用SP6和T7 RNA聚合酶通过体外反转录合成地高辛标记的NCAM cRNA正义、反义探针。地高辛标记试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。杂交方法参照文献［1］。冰冻切片37℃烘片12 h，0.3%Triton X-100/0.1 mol/L PBS (pH=7.2)洗，加1 μg/ml蛋白酶K于37℃消化30 min，0.1 mol/L 甘氨酸/0.1 mol/L PBS洗15 min，4％多聚甲醛/0.1 mol/L pBS室温固定10 min，用新配制的0.25％乙酸酐三乙醇洗15 min，取NCAM反义cRNA探针按2μg/ml加入杂交缓冲液（50％去离子甲酰胺，10％葡萄糖硫酸酯，1×Denhardt液，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/LEDTA，0.25 mg/ml变性鲑精DNA，10 mmol/L DTT），每张切片中加25μl，湿盒内 50℃孵育12 h，杂交后分别以37℃ 4×SSC，2×SSC，1×SSC，0.5×SSC各洗15 min，加碱性磷酸酶标记的1∶500抗地高辛抗体Fab片段25℃孵育4 h， Buffer Ⅰ， BufferⅡ各洗10 min，加NBT-BCIP显色液显色，观察颜色变化直至阳性结果出现后，脱水，透明，封片。
1.2.2免疫组织化学石蜡切片常规脱蜡和水化， 0.3％H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，置0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（pH=7.6）中，微波加热， 10档×1 min后，再3档×10 min进行抗原修复，加鼠抗人NCAM单克隆抗体(为Dako公司产品)过夜，加生物素标记的第二抗体20 min，加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液(为Maxim Biotech公司产品)20 min， 0.05％DAB/0.03％H2O2显色10 min，苏木精复染，封片。
1.3对照以NCAM阳性的U87阳性细胞为阳性对照，以NCAM正义cRNA探针作为阴性对照，以PBS缓冲液代替NCAM一抗作阴性对照。
1.4结果判定显微镜下原位杂交细胞质内出现蓝色颗粒或团块者，免疫组化细胞质与胞核内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，阳性细胞在高倍视野下占细胞总数的5％以上为阳性，反之为阴性。阳性细胞计数：以病理指数（pathological index,PI）来表示，即：每张切片随机观察20个高倍视野，对阳性肿瘤细胞计数，阳性瘤细胞占视野内肿瘤细胞总数的25％以下计1分；占26％～50％计2分；占51％～75％计3分；占75％以上的计4分。20个视野的PI值相加后即为该例标本的PI值。
1.5统计学处理阳性率的比较采用χ2检验；两均数的比较采用t检验。
2结果
2.1原位杂交结果显示NCAM mRNA阳性产物主要定位于细胞质内(图1)，3例正常脑组织标本及3例脑膜瘤中未见NCAM mRNA的表达。星形细胞瘤低级别组（1，2级）染色阳性率为85.7%(18/21)，高级别组（3，4级）为47.3%(9/19)，两组差别显著(P＜0.01)；低级别组（1，2级）PI值为29.28±12.62，高级别组（3，4级）为14.89±10.81，两组差别显著(P＜0.01)。
2.2免疫组化染色结果显示NCAM蛋白阳性产物主要定位于细胞质与胞核内(图2)，3例正常脑组织有1例呈阳性表达，3例脑膜瘤标本中未见CD56的表达。星形细胞瘤低级别组（1，2级）染色阳性率为76.2%(16/21)，星形细胞瘤高级别组（3，4级）为36.8%(7/19)，两组差别显著(P＜0.01)；星形细胞瘤低级别组（1，2级）PI值为33.62±17.47，高级别组（3，4级）为10.26±5.77，两组差别显著(P＜0.01)。
2.3NCAM免疫组化结果与原位杂交结果的比较40例新鲜标本中，13例免疫组化和原位杂交结果均为阴性，23例均为阳性，4例免疫组化阴性、原位杂交阳性。比较免疫组化和原位杂交结果的一致性，经统计学处理显示两者结果一致。
图 1NCAM mRNA原位杂交表达阳性（×400）
fig 1The positive expression of NCAM mRNA in human brain astrocytoma with in situ hybridization（×400）
图 2NCAM 蛋白(CD56)免疫组化表达阳性（×400）
fig 2The positive expression of CD56 in human brain astrocytoma with immunohistochemical staining（×400）
3讨论
肿瘤细胞的表面粘附特性的改变是肿瘤侵袭转移的重要特征［2］，细胞间粘附力的下降导致肿瘤细胞从原发肿瘤处分离并播散到远处。细胞粘附分子在肿瘤细胞和细胞外基质之间的作用被广泛研究，并发现它们在肿瘤的侵袭转移中起重要作用。Cunningham等［3］发现NCAM，并将其基因定位于11号染色体，蛋白编码产物有4种。大量研究表明NCAM在许多人肿瘤中有表达，但在不同肿瘤中的表达情况不同，在消化系统肿瘤中，如：胰腺癌、结直肠癌中，NCAM的高表达可限制肿瘤细胞的扩散转移，这类患者的预后较好，同时发现它与肿瘤沿神经周围侵袭呈正相关［4］。而在肺癌中作为SCLC的一种肿瘤标志物，其表达水平与病程进展呈正相关［5］。
本研究结果表明，NCAM mRNA及其蛋白在正常脑组织与脑膜瘤中的表达为阴性或表达率很低，在星形细胞瘤中表达明显增高，星形细胞瘤3，4级的NCAM mRNA及蛋白表达阳性率与PI值均要明显低于星形细胞瘤1，2级，低级别组（1，2级）与高级别组（3，4级）间比较有显著差异（P＜0.01），这提示NCAM的低表达可能与星形细胞瘤的侵袭转移有关。具体机制可能是NCAM在高级别星形细胞瘤中表达减少，产生细胞间粘附力减弱，进而促进了肿瘤细胞对周围组织的侵袭转移。对NCAM mRNA在星形细胞瘤中的表达及作用的研究，目前大多集中于体外细胞实验，Edvardsen等［6］将编码人NCAM-140的全长cDNA转染至鼠星形细胞瘤细胞系，转染NCAM的BT4Cn细胞经开颅手术植入颅内后发现较对照组肿瘤细胞的生长较局限，细胞迁移实验证实这种转染细胞的侵袭力较弱，同时对mRNA的定量检测发现肿瘤侵袭力愈强，NCAM水平愈低，表明NCAM-140 mRNA的表达与肿瘤侵袭力呈负相关，这与本研究的结论一致。在蛋白水平上，Yamanaka等［7］对12例星形细胞瘤进行免疫组织化学分析发现有11例呈NCAM高度表达，而正常脑组织表达阳性率较低；对两个星形细胞瘤细胞株进行分析表明，星形细胞瘤细胞中约有75％的细胞呈NCAM阳性。Garin-Chesa等［8］应用针对人NCAM的鼠Mab3.1H11检测9例星形细胞瘤，发现全部呈强阳性。本研究采用SP法，并用微波抗原修复及抗原与抗体结合时间比较长等措施得到比较理想的结果，与Yamanaka，Garin-Chesa的结论基本一致，与上述相比其NCAM蛋白阳性率较低，这可能与选择的抗体不同有关。
有些学者对蛋白与mRNA的关系开展研究。Andersson等［9］对两个星形细胞瘤细胞株BT4C，BT4Cn进行分析，后者较前者具有更高的侵袭能力，同时发现在BT4C星形细胞瘤细胞中NCAMmRNA与蛋白都表达，而在BT4Cn星形细胞瘤细胞中仅有NCAM mRNA表达，而NCAM蛋白无表达，两者的表达并不同步，表明蛋白的表达不仅依赖于mRNA水平，同时有其他调控机制的参与。本研究用原位杂交与免疫组化方法同时对标本进行NCAM在星形细胞瘤中的表达检测，结果表明NCAM mRNA与蛋白具有较好的一致性，提示NCAM的表达改变可能发生在转录或转录以上水平，另外因为免疫组化方法较原位杂交简便易行，这为临床推广免疫组化检测NCAM蛋白表达提供了理论依据。NCAM的表达可作为临床判断星形细胞瘤恶性生物学行为和术后继续治疗的参考依据。
