第二军医大学学报2000年第21卷第3期

李玫吴宗贵秦永文仲人前张玲珍李莉马鹏程

摘要目的：观察雷公藤甲素（T₁₀）对肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素6（IL-6）在平滑肌细胞（SMC）、腹腔巨噬细胞（MΦ）的分泌以及在小鼠体内诱生的影响。方法：体外主动脉SMC培养，腹腔注射给药及眼球摘除取血，细胞毒结晶紫染色法测定TNF，依赖细胞株MTT比色法测定IL-6。结果：T₁₀注射浓度（0～0.375 mg/kg）与小鼠血清中TNF，IL-6水平呈显著负相关（P＜0.01）；腹腔MΦ培养上清中TNF及IL-6分泌与T₁₀给药浓度（0～1.1μmol/L）呈显著负相关（P＜0.01）；0.275μmol/LT₁₀对指数增殖期SMC自分泌及在脂多糖（LPS）、氧化修饰低密度脂蛋白胆固醇（oxLDL）刺激下分泌TNF，IL-6，TNF和IL-6的相互诱生亦有明显抑制（P＜0.01）。结论：T₁₀可以抑制TNF，IL-6的体内外诱生。

关键词：雷公藤甲素；平滑肌细胞；肿瘤坏死因子；白细胞介素6

动脉粥样硬化（AS）的机制尚未完全阐明。近年研究提供大量证据表明炎症、免疫机制参与AS过程：在血管损伤部位的AS病灶中的细胞成份如内皮细胞（EC）、平滑肌细胞（SMC）、巨噬细胞（MΦ）和T淋巴细胞都具有免疫活性，通过合成、分泌细胞因子、生长因子参与AS的发生、发展，并影响其并发症的预后。本文研究具有抗炎、免疫抑制作用的单体雷公藤甲素(T₁₀)对炎性细胞因子TNF，IL-6在体内外诱生的影响，探讨该类药物在冠心病防治中的潜在作用。

1材料和方法

1．1动物与试剂健康纯种新西兰白兔5只，雄性，体质量1.5～2.0 kg。ICR昆明种小鼠40只，8～12周龄，体质量约30 g，雌雄兼用（第二军医大学实验动物中心提供）。细胞株：L₉₂₉细胞株（第二军医大学微生物学教研室），B₉细胞株（长征医院血液科）。T₁₀（中国医学科学院协和医科大学皮肤病研究所，纯度＞98％），RPMI1640培养基（Gibco, US），抗肌动蛋白单克隆抗体、卡西霉素（A23187），LPS，LDL（溶于10μmol/L CuSO₄中，37℃温育24 h，制备成oxLDL^［1］）、放线菌素D（Sigma，US），rHu-TNF（日本Dainippon制药公司，活性为1×10⁷ u／ml），rHu-IL-6（美国Genetics Institute，活性为5.9×10⁴ u/ml），小牛血清（NCS：华美），卡介苗（BCG）（上海生物制品研究所）。

1．2方法

1．2．1体外诱生（1）小鼠腹腔MΦ^［2］：ICR小鼠10只颈椎脱位法处死，冷D-Hank液冲洗小鼠腹腔3次，合并冲洗液离心、洗涤，并除去红细胞。用含10％NCS rPMI 1640培养液调整细胞密度为10⁶个/ml，以1 ml/孔加入24孔板，5%CO₂培养箱中贴壁2 h，倾去上清液，洗涤后加入A23187（1 mmol/L）继续培养6 h，然后每孔加入含有不同浓度T₁₀（每种浓度设5个复孔）和LPS（100 ng/ml）的培养液，继续培养6 h，收集上清，－20℃冻存待测TNF；继续培养24 h，收集上清冻存待测IL-6。 不同处理方式对MΦ分泌TNF及IL-6的影响：①以0.275μmol/L T₁₀预处理MΦ 2 h，洗涤后再与LPS共育6 h或24 h；②将0.275μmol/L T₁₀与LPS加入MΦ培养液中共育6 h或24 h，分别收集培养上清待测TNF及IL-6。（2）兔主动脉SMC：无菌分离兔主动脉中膜，组织贴块法原代和传代培养SMC，培养的细胞经形态学、抗肌动蛋白单抗免疫细胞化学染色证实为SMC，无内皮细胞、成纤维细胞污染。以含20% nCS RPMI 1640培养液培养的SMC为指数增殖期细胞，经0.5% NCS同步化培养的SMC为静止期细胞。实验采用传3～6代生长状态良好的SMC制成悬液，以3×10⁴/孔接种到24孔板上，20％ nCS培养液培养24 h后形成细胞单层，弃上清，加入含有T₁₀和诱生剂（每种设3个复孔）的无血清培养液，继续培养24 h后，收集上清冻存待测。另取一组已形成单层的SMC以0.5% NCS同步化培养24 h后，无血清培养24 h，收集上清待测TNF及IL-6。

1．2．2体内诱生^［3］ICR小鼠20只随机分为对照组和3个实验组，均于腹腔注射BCG溶液0.2 ml（含BCG 7.5 mg），实验组于次日起连续6 d腹腔注射不同浓度T₁₀溶液0.2 ml（给药浓度分别为0.125，0.25，0.375 mg/ml），对照组注射等量生理盐水。于第6天给药1 h后腹腔注射0.2 ml LPS溶液（含LPS 1 μg），90 min后摘除眼球收集血液，4℃放置过夜，离心取血清，56℃水浴灭活，冻存待测TNF及IL-6。

1．2．3TNF，IL-6的生物活性测定采用L₉₂₉作为靶细胞的细胞毒结晶紫染色法测定TNF^［4］。采用IL-6依赖性细胞株B₉的MTT比色法测定IL-6的活性^［5］。

1．3统计学处理数据以±s表示，采用t检验、方差分析和直线相关分析。

2结果

2．1T₁₀体外抑制小鼠腹腔MΦ产生TNF及IL-6的量效关系（1）T₁₀对经A23187启动后的LPS刺激的小鼠腹腔MΦ分泌TNF和IL-6均有抑制作用，且随T₁₀浓度增加抑制作用增强。T₁₀浓度与上清中TNF，IL-6的活性单位数间呈显著负相关（分别为r=－0.9233，P＜0.01；r=－0.931 7，P＜0.01），见图1。（2）不同处理方式的影响：以0.275μmol/L T₁₀预处理MΦ 2 h，洗涤后再与LPS共育6 h或24 h后所得的TNF为(65.53±5.06) u，IL-6为 (57.67±5.53) U；而将0.275 μmol/L T₁₀与LPS同时加入MΦ培养液共育6 h或24 h后，所得TNF为(57.93±4.40) U，IL-6为(41.55±5.60) U。两种处理方式均使TNF及IL-6水平下降，但后者作用更为明显，抑制程度更强（对TNF的抑制率分别为37.56%和44.81%；IL-6的抑制率分别为32.77%和41.55%）。

图1T₁₀体外抑制小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF及

iL-6的量效关系

fig 1Dose-dependent effect of T₁₀ on secretion

of TNF and IL-6 from mice peritoneal

macrophages in vitro

n=5; ○:TNF; ●: IL-6

2．2T₁₀对体外SMC产生TNF和IL-6的抑制作用LPS10 μg/ml，oxLDL 5 μg/ml和IL-6 20 U/ml或TNF 10 U/ml与指数生长期SMC共育24 h，均能不同程度地诱生TNF ［(96.42±8.27) U, (72.56±7.37) U和(64.33±5.12) u］ 和IL-6［(76.38±8.36) U, (62.26±7.49) U和(83.32±9.11) U］。指数生长期SMC本身亦分泌少量TNF(6.43±2.16) u和IL-6 (25.00±4.45) U。加入0.275 μmol/L T₁₀则能显著抑制TNF［(39.08±4.12) u, (23.54±3.57) U和(13.67±3.01) U］及IL-6［(31.34±5.03) U, (26.37±4.21) u和(43.62±6.02) U］的分泌。静止期SMC的培养上清内未测到TNF及IL-6。

2．3T₁₀对LPS体内诱生TNF，IL-6的影响ICR小鼠注射BCG后第7天再注射LPS，90 min后血清中出现高水平的TNF及IL-6活性。但是，若在注射LPS之前，连续6 d给小鼠腹腔内注射不同浓度的T₁₀（0.125，0.25，0.375 mg/kg），于末次给药后1 h再注射LPS，90 min后取血，则小鼠血清中TNF及IL-6水平均显著降低，T₁₀浓度与血清中TNF及IL-6水平呈显著负相关（分别为r=－0.9874，P＜0.01；r=－0.973 1，P＜0.01），见图2。

图2T₁₀抑制LPS对TNF，IL-6的体内诱生

fig 2Inhibition of T₁₀ on the secretion of TNF

and IL-6 induced by LPS in vivo

n=5; ○：TNF； ●：IL-6

3讨论

本研究中曾将T₁₀以不同浓度直接加在培养液中观察其对L₉₂₉细胞和B₉细胞的直接作用。发现当所加的药物浓度与所稀释的待测上清中所含T₁₀的最高浓度相同时，对这些细胞株的生长既无抑制也无促进作用。因此，培养上清中残留的药物对细胞因子的测定无直接影响。近年来的研究证实，粥样硬化动脉壁有单核-MΦ和T淋巴细胞浸润，细胞因子表达增加^［6］。血管壁损伤部位的细胞既是细胞因子的来源，又是它们作用的靶细胞，而炎性细胞因子如TNF和IL-6是炎症和免疫反应的介质，也是细胞之间相互作用的媒介，它们的作用呈“网络效应”，共同调节血管壁细胞的损伤反应，影响AS发生发展，在维持和放大炎性增殖反应中起着重要的作用。因此，减少局部炎症免疫反应、阻断炎性介质网在AS的防治中具有积极的意义。

T₁₀是雷公藤的主要活性成份之一，属活性最高的环氧化二萜内酯化合物，