第四军医大学学报2000年第21卷第5期

杨康刘维永

摘要： 目的观察补体调节蛋白CD₅₉和CD₄₆在创伤性急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)动物肺组织中的表达变化，并探讨其在ALI和ARDS发病机制中的意义.方法采用右胸撞击建立创伤性ALI和ARDS模型.用免疫组化和原位杂交技术检查ALI和ARDS家猫肺组织中CD₅₉，CD₄₆的表达情况.结果伤后12 h ALI动物肺组织中CD₅₉，CD₄₆表达上调,24 h最为明显，48～72 h减弱. ARDS动物肺组织中CD₅₉，CD₄₆表达明显下调.结论伤后早期，CD₅₉，CD₄₆表达上调，加强了组织细胞对补体攻击的自我保护机制；ARDS时，CD₅₉，CD₄₆表达下调可能是炎性损伤加重的原因之一.

关键词：CD₅₉；CD₄₆；急性肺损伤；急性呼吸窘迫综合征

0引言

CD₅₉和CD₄₆是重要的补体调节蛋白，前者在终末阶段抑制攻膜复合物（MAC）的组装，后者抑制C3转化酶形成并加速其降解.生理情况下，CD₅₉和CD₄₆在补体级联反应中的不同阶段抑制补体活化，保护自身组织免受补体攻击.但在特定的病理过程中其表达和意义尚未明了.我们在建立创伤性急性肺损伤(ALI)的基础上，应用免疫组化和分子杂交技术，对创伤性ALI和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中CD₅₉，CD₄₆在肺组织中的表达情况进行检查，初步了解补体调节蛋白在创伤性ALI和ARDS中变化趋势，探讨补体介导组织损伤的机制.

1材料和方法

1.1材料健康家猫18只，雌雄不拘，体质量1.5～2.0 kg，戊巴比妥钠30 mg·kg^-1 ip麻醉，分别经颈动、静脉插管，用于血压监测和输液取样.动物置于XJ多功能气动式撞击机上，于吸气末单次准静态撞击右胸侧壁，撞击参数：速度为15 m·s^-1，胸廓压缩为20%，撞击面积为5 cm×6 cm.伤后ALI诊断标准：①呼吸频率持续增加2倍以上；②动脉血PaO₂降低；③X光片示伤侧肺密度普遍增高；④病理检查示伤侧肺和非伤侧肺均充血、水肿、白细胞浸润. aRDS诊断参照实验动物ARDS诊断标准^［1］. 18只动物中，有8只分别于伤后6，12，24和48 h放血活杀；余下10只中有4只分别于伤后43，46，52和60 h发生ARDS，其余6只符合ALI诊断标准，均于伤后72 h放血活杀. 动物活杀后立即以40 mL·L^-1多聚甲醛灌注固定，取肺组织于4℃下40 mL·L^-1多聚甲醛固定12 h，石蜡包埋备用. CD₅₉，CD₄₆ mAb由第三军医大学免疫教研室提供.

1.2方法①石蜡切片脱蜡至水，经体积分数为30 mL·L^-1 H₂O₂封闭内源性过气化物酶后，用体积分数为50 mL·L^-1的正常羊血清封闭30 min，分别滴加CD₅₉，CD₄₆ mAb反应30 min，PBS冲洗后加生物素化羊抗鼠二抗37℃反应30 min；加ABC复合物37℃孵育30 min，DAB显色后，二甲苯透明、封片. ②CD₅₉，CD₄₆ cDNA片段由第三军医大学免疫教研室提供.参照地高辛标记检测试剂盒（Boehringer Mannhein公司）说明书，采用随机引物法标记.石蜡切片脱蜡至DEPC水，分别用0.2 mol·L^-1 HCl和20 mg·L^-1的蛋白酶K处理，梯度乙醇脱水后室温干燥.用地高辛标记的CD₅₉，CD₄₆探针于42℃杂交后，依（Fig1A, 2A, 3A, 4A)次用2×SSC，1×SSC，0.5×SSC，buffer 1，buffer 2充分洗涤，用体积分数为20 mL·L^-1正常羊血清封闭30 min后，滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体2 h；buffl 1，buffl 3洗涤，加新配制好显色液（NBT/BCIP显色系统）20 μL，暗处显色.中止显色后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明封片.

2结果

正常肺组织中支气管粘膜上皮、肺泡隔毛细血管网和肺泡上皮细胞CD₅₉，CD₄₆的免疫组化染色和分子杂交呈阳性表达，两个分子蛋白质水平和mRNA水平表达的细胞定位基本一致，其mRNA表达以胞质为主(Fig1A, 2A, 3A,4A). ALI 动物伤后12 h肺组织中CD₅₉，CD₄₆表达开始上调,24 h最为明显(Fig 1B, 2B, 3B,4B)， 48～72 h减弱. ARDS动物肺组织中CD₅₉，CD₄₆表达明显下调(Fig1C, 2C, 3C, 4C).

图1CD₅₉免疫组化染色

fig 1Immunohistochemical staining for CD₅₉×250

a: Positive in normal lung tissue； B: Increased expression in lungs of ALI cats at 24 h posttrauma； C: Decreased expression in lungs of ARDS.

图2CD₄₆免疫组化染色

fig 2Immunohistochemical staining for CD₄₆×250

a, B, C: The same as Fig 1A, 1B, 1C.

图3CD₅₉原位杂交染色

fig 3In situ hybridization for CD₅₉×250

a, B, C: The same as Fig 1A, 1B, 1C.

图4CD₄₆原位杂交染色

fig 4In situ hybridization for CD₄₆×250

a, B, C: The same as Fig 1A, 1B, 1C.

3讨论

创伤后补体激活成分升高，并与ALI和ARDS密切相关，说明补体系统参与了创伤后机体的炎症反应^［2-5］. cD₅₉，CD₄₆作为重要的补体同源限制因子，广泛分布于红细胞、白细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等.这种分布的广泛性反映了机体普遍存在的自我保护机制.但是，CD₅₉和CD₄₆在创伤性ALI和ARDS中有何意义至今未见报道.我们用免疫组化和原位杂交技术，初步观察了创伤性ALI和ARDS中CD₅₉和CD₄₆的表达情况.发现伤后ALI动物内脏组织中CD₅₉，CD₄₆的表达明显上调，提示创伤性ALI中补体系统具有双向作用，一方面补体成分激活，介导炎性损伤，另一方面补体调节蛋白表达上调，降低组织细胞对补体的敏感性，加强了自我保护机制.本研究还发现，ARDS动物肺组织中CD₅₉，CD₄₆表达均一致下调，这一变化是组织损伤的原因还是结果目前尚不清楚.推测有两种可能：①ALI和ARDS是全身炎症反应综合征（SIRS）在肺部表现的不同阶段，ARDS是ALI的严重结局.伤后早期，即ALI阶段，除炎性介质引起SIRS外，尚有内源性抗炎因子和介质释放引起和代偿性抗炎反应综合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS)^［6］，此时SIRS和CARS可能处于抗衡状态.肺组织中补体调节蛋白表达上调，降低组织细胞对补体敏感性，加强了自我保护机制.如CARS占优势，SIRS得以控制；肺部表现为 ALI减轻，CD₅₉和CD₄₆表达可下调.如炎症反应继续发展，SIRS占优势，炎症反应失控，肺部表现为ALI加重，最终发展为ARDS，通过尚未明了的机制使补体调节蛋白表达CD₅₉和CD₄₆下调，自身保护作用减弱或丧失，组织细胞遭受补体攻击.此时，CD₅₉，CD₄₆等补体调节蛋白表达下调是组织损伤的原因之一.②CD₅₉，CD₄₆表达下调可能是ARDS时细胞损伤的结果，ARDS时，组织细胞损伤严重.本组在电镜观察中发现，ARDS动物的肺组织中细胞极度肿胀、细胞器减少或消失、核变稀疏.而CD₅₉，CD₄₆为细胞膜上的锚固蛋白，细胞损伤后释放的磷脂酶水解分子上的GPI链，使CD₅₉，CD₄₆脱落，细胞膜上分子数减少.

作者简介：杨康(1964-)，男(汉族)， 云南省昆明市人. 博士.Tel.(029)3375311Email. jinzx@fmmu.edu.cn杨康（第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西西安 710033)

刘维永（第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安710033）

参考文献：

［1］ Hu S, sheng ZY, Tian HM. A clinically relevant model of multiple system organ failure in the rabbit ［J］. Circ Shock, 1991;34(1):70-74.

［2］ Donnelly TJ, Meade P, Jagels M et al. Cytodine, complement, and endotoxin profiles associ