陕西师范大学学报2000年第28卷第1期

高美丽¹, 王宪锋², 杨建雄¹

摘 要：恶性疟原虫感染的红细胞可粘附于各种器官的微血管内皮细胞，这种粘附被认为是红细胞膜表面分子与内皮细胞表面分子间配体-受体相互作用的结果。研究表明硫酸软骨素A（chondroitin sulfate A ，CSA）在粘附中起着重要作用。对CSA粘附机制的阐明不仅可丰富细胞间粘附的理论，深化对重症疟疾发病机理的理解，也有助于抗疟药物的研究和抗粘附疟疾疫苗的设计。本文试就近年来有关CSA粘附研究的一些最新进展作以简要综述。

关键词：恶性疟原虫；硫酸软骨素A；粘附；恶性疟原虫红细胞膜蛋白1

恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）感染的红细胞（infected red blood cell，IRBC）可粘附于各种器官的微血管内皮细胞（即“扣押”）以逃避宿主脾免疫机制的清除，同时，IRBC在微血管内的大量聚集将引起凶险型疟疾。“扣押”可能是多种不同IRBC表面与内皮细胞表面粘附分子相互作用的结果。体外研究表明很多分子都可作为IRBC的受体，包括CD36、细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血小板反应素（thrombospondin,TSP）、血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1）、E-selectin、P-selectin、硫酸软骨素A（chondroitin sulfate A，CSA，即硫酸-4-软骨素)、 v3-integrin和血小板内皮细胞粘附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1/CD31 ）。其中CSA在疟疾的病理发生中作用最明确，即可引起妊娠疟疾。

1 CSA是内皮细胞表面IRBC的粘附受体

IRBC与多种细胞的粘附试验均表明CSA可介导IRBC的粘附。IRBC与Saimiri猴脑内皮细胞（Saimiri brain endothelial cells，SBEC）的结合可被抗受体的单抗阻断，该单抗与SBEC的结合可被CSA部分阻断。竞争性抑制分析表明，CSA几乎能完全抑制IRBC的粘附，而透明质酸、硫酸-6-软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素或软骨素-4S-二糖则均无抑制性^[1]。Rogerson等也发现^[2]，IRBC与中国仓鼠卵细胞（Chinese hamster ovary ，CHO）和C32黑色素瘤细胞的结合须依赖于CSA，CSA缺陷的糖基化突变体结合力较弱或不能结合。用软骨素酶ABC和AC可抑制IRBC与SBEC的粘附，而软骨素酶B则无此效应^[1]，以软骨素酶处理野生型CHO也可得到类似结果^[2]。可溶性CSA可抑制泰国株恶性疟原虫寄生的IRBC与C32的结合，并呈剂量依赖性^[3]。

直接取自人胎盘的IRBC可结合于纯化的CSA，而与其他细胞外基质蛋白和已知的IRBC受体不能结合^[4]。将胎盘IRBC与新鲜冷冻的未感染胎盘孵育1小时，然后小心洗去未结合的IRBC，发现IRBC优先结合于滋养层绒毛、细胞外绒毛和合胞体桥，与体内天然感染的胎盘IRBC分布基本一致^[4]。将游离CSA加入结合介质或预先以软骨素酶ABC处理胎盘合胞体滋养层，可显著降低IRBC与合胞体滋养层的结合^[5]。免疫荧光研究在合胞体滋养层可见到ICAM-1和CSA，但即使在有TNFα刺激下也未发现CD36、E-selectin和VCAM-1的表达，这些分子的抗体对粘附也无抑制性^[5]。说明IRBC可与CSA结合，CSA是IRBC粘附于内皮细胞的一种受体。此外，有研究表明CSA也存在于人肺的内皮细胞介导IRBC的粘附^[6]。

2 血栓调节素（Thrombomodulin,TM）是以CSA作为IRBC的粘附位点

TM广泛分布于血管内皮，并高表达于胎盘合胞体滋养层。免疫荧光实验表明，与IRBC粘附的SBEC可表达CSA-蛋白多糖，即CD44和TM，但不表达CD36和ICAM-1^[7]。软骨素酶处理TM可抑制内皮细胞、合胞体滋养层与IRBC的结合，游离CSA亦具有此效应，不同浓度CSA可抑制IRBC与TM表达细胞或固定TM的结合。因此，TM的CSA链可介导IRBC的结合^[8]。Rabhi-Sabile等^[9] 将鼠TM的CSA结合位点突变，并在COS-7细胞表达该突变体(TMsergly)。在粘附分析中，含有CSA的野生型TM可粘附1466 iRBCs/mm2，而TMsergly突变体仅仅粘附200 IRBCs/mm2，进一步证明了TM是以CSA作为IRBC的粘附位点。Gysin等^[10]的研究结果也支持这一观点。

3 CSA与IRBC粘附的特征

Pouvelle等^[7]给Palo-Alto (FUP) 1恶性疟感染的猴注射CSA后，含成熟虫体的IRBC被释放至外周血循环。在体外，血循IRBC与CSA孵育前，CSA不能抑制二者的结合，孵育8小时后，CSA的抑制率高于90%。表明外源CSA在体内和体外均可抑制IRBC的粘附。

为确定CSA在结合上具有重要作用的结构特征，从CSA和CSC分离出2到20个单糖单位大小不等的片断，作为IRBC结合固定受体的竞争性抑制剂，以软骨素裂解酶消化为对照，发现粘附抑制高度依赖于CSA分子的大小^[11]：十四糖链CSA是几乎可完全抑制结合的最小长度片段。该效应具有剂量依赖性，类似于完整蛋白多糖，而CSC寡糖无此效应。十四糖链CSA对IRBC与其他受体CD36和ICAM-1的结合没有影响。十六、十八糖链CSA可最大程度抑制IRBC与TM的结合。寡糖和多糖片段的电子云质谱测定法和高效液相色谱法分析表明，CSA和CSC活性的区别在于硫酸含量和硫酸的构型，艾杜糖醛酸与IRBC的结合无关。

CSA粘附为pH非依赖性，在所粘附内皮细胞的生理pH下粘附性最强。与此相比，CD36和ICAM-1的粘附为pH依赖性，需要酸性条件方可达到最大。因此有人推测^[12]，CSA粘附可能触发微血管阻塞，引起必要的酸化，为其他受体发挥粘附效应提供条件。

在可控制的流体状态下，壁切向压达0.2 Pa（在小静脉的生理压力范围内）时IRBC与CSA的粘附呈浓度依赖性。一旦结合，IRBC即保持静止而不再滚动。当提高壁切向压时IRBC仍保持不动，直到2.5 pa时有一部分IRBC脱离。可溶性CSA在药理学浓度可浓度依赖性阻止流动的IRBC的粘附，但不能使已经建立的粘附逆转^[13]。

未孕志愿者外周血IRBC可与CD36结合而不结合CSA，孕妇胎盘IRBC的结合特征与之相反，孕妇外周血中IRBC则具有CD36和（或）CSA的粘附表型，说明妊娠疟疾是由具CSA粘附特性的特定恶性疟原虫亚群所致^[4]。肯尼亚初孕妇和男性血清不能抑制IRBC与CSA的结合，而再孕妇和经孕妇血清表现出明显的抑制性。与再孕妇和经孕妇相比，缺乏抗粘附抗体的初孕妇更易出现胎盘感染和较高的血虫水平，表明抗CSA粘附的抗体活性可能是获得性体液免疫反应的结果，可保护妇女在孕期免于疟疾感染^[14]。肯尼亚和Thai-Burmese经孕妇血清对两地疟原虫的CSA粘附均有抑制性，而初孕妇血清则对其中任何一者都无抑制性，提示CSA的抗粘附抗体无株依赖性^[14]。

4 CSA的配体是恶性疟原虫红细胞膜蛋白1

Reeder等^[15]的研究结果表明，IRBC与CSA的粘附由恶性疟原虫红细胞膜蛋白1（Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,PfEMP1）介导。从亲代克隆FAF-EA8中筛选出具CSA粘附性的CS2克隆，前者可高水平结合ICAM-1和CD36，但仅低水平结合CSA，后者与ICAM-1和CD36无结合性，但显著上调与CSA的结合。对二者cDNA进行扩增，在CS2克隆发现一特异性var基因，而亲代克隆FAF-EA8则没有。实验证明该基因与CS2特异性变异体表面蛋白PfEMP1的表达有关。

PfEMP1（200～350KD）是一个重要的靶抗原家族，在红内无性血期由var基因表达，通过某种未知的方式运输至所寄生的IRBC表面，然后插入到IRBC膜上，显著地暴露在外，可进行抗原变异，具有高度多态性。目前的研究认为，PfEMP1不仅参与IRBC与微血管内皮细胞的粘附，也参与玫瑰花结的形成，可能是一种起主要作用的虫源性粘附分子，在重症疟疾的病理发生上具有重要作用。

尽管PfEMP1是变异分子，但它仍具有一些共同的结构^[16]。编码PfEMP1的 var基因是一个多基因大家族，约占恶性疟原虫基因组的6%，含50～150个成员，每个var基因10～12kb，具两个外显子：5’外显子高度多态，编码PfEMP1的胞外区和跨膜区，含几个Duffy样结合结构域（Duffy-binding like domain，DBL），DBL1与DBL2之间有一个结构域间半胱氨酸富含区（cysteine-rich interdomain region，CIDR），CIDR与DBL1共同构成保守的头部结构，其后为1～3个可变结构域；3’外显子十分保守，编码PfEMP1胞浆内的酸性末断区（acidic terminal segment，ATS），可能与膜下结构蛋白相作用。

与DBL1、DBL4或ATS抗血清相比，CS2-var的CIDR和DBL3抗血清对CS2粘附于CSA具显著抑制性^[15]。但仍不能确定结合CSA的结构域，因为某个结构域抗体的结合可能阻碍了相邻结构域的结合（CS2-var基因的CIDR与DBL3相邻），也可能融合蛋白缺乏天然蛋白构型而限制了其他潜在结合结构域的抗体活性。由于虫体表达的CSA配体在抗原性上是保守的^[14]，推测结合CSA的结构域可能具有保守的结构特征。

5 结语

恶性疟原虫红内期早期循环于血流，而成熟期可粘附于多种器官的微血管内皮细胞，IRBC也可与正常红细胞结合形成玫瑰花结。对疟原虫而言，粘附于微血管内皮细胞可使其免于脾的特异性和非特异性清除，利于其生存；对宿主人而言，大量IRBC在微血管的聚集，造成血流阻塞，导致重症疟疾的发生。在与IRBC相作用<