中国修复重建外科杂志2000年第14卷第3期

王坤杰李幼平杨宇如

摘要目的了解异种移植物抗宿主病(GVHD)的组织学特点，与同种GVHD的区别及异种脾脏移植的关系。方法对近十年来有关异种移植中GVHD的特点及其与同种GVHD区别的文献进行检索、综述。结果异种GVHD由于共刺激信号、粘附分子的不匹配及所识别抗原的差异，其发生发展速度、组织学特点等均与同种GVHD不同。受体脾切除加异种脾移植有利于异种GVHD的发生。结论可利用异种GVHD模型来观测异种移植排斥反应及检测异种供器官抗原相似性。

关键词：移植物抗宿主病猪→人异种移植脾脏

随着同种异体器官移植的广泛开展，同种供器官短缺问题日益突出。异种移植除可提供大量供器官外，还有可通过改造供体来满足移植需要及用于一些现在尚无较好治疗方法的疾病如艾滋病及乙型肝炎^［1］的优点。移植界现将猪作为最适异种供器官动物，集中研究猪异种抗原及引起的异种排斥反应，并对其进行基因改造。目前，研究中应用最多的是猪→非人灵长类动物移植模型，但其最大缺点是非人灵长类动物与人仍有较大差别，不能完全反映猪→人移植的情况。因此，有必要建立一种能直接观测猪→人异种移植所发生的各种免疫反应的大动物模型。

移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)，即移植后发生的供者免疫活性成份对受者的攻击。若能建立一种异种GVHD模型，将有可能在受者体内观察供者(动物A)对受者(动物B)的攻击，特别是在不能直接进行动物B到动物A移植的情况下，可在一定程度上模拟动物B到动物A移植所遇到的排斥反应情况。例如建立人→猪移植的GVHD模型，可避开直接进行猪→人异种移植所存在的医德、伦理问题，动态观察人免疫活性成份对猪器官、组织的攻击情况，而且可能直接观察猪→人异种移植可能遇到超急性排斥反应以后的排斥反应。为利用异种GVHD作为研究猪→人异种移植排斥反应的动物模型，对异种移植中GVHD的特点及其与同种GVHD的区别进行综述。

1异种移植物抗宿主病的发生和发展

现尚无专门诱导异种GVHD的模型。可供借鉴的异种GVHD模型以人→严重联合免疫缺陷(severe combine immunodificiency,SCID)小鼠或免疫抑制鼠的免疫细胞移植模型应用最广泛。应用异种骨髓或脾细胞移植诱导嵌合或耐受的大动物模型中因有GVHD发生，亦可作为异种GVHD模型。

SCID鼠输入人脾细胞或外周血淋巴细胞后2～3周在外周血出现人CD3^+［2］，比例较低，多为HLA/DR^-的小淋巴细胞，同时脾脏出现HLA／DR⁺细胞。SCID鼠白髓缩小，鼠L3T4⁺细胞周围包围着供者细胞。在全身各处淋巴结散布人细胞，表型与脾脏中相同，皮质区与副皮质区无明显差异。几周后出现三种不同的结局。半数小鼠嵌合程度下降并最终消失；另一小半嵌合稳定并持续较长时间；而少部分小鼠外周血人T细胞数量逐渐增加，形态增大呈浆细胞样，活化并表达HLA-DR，小鼠出现GVHD症状，但在发生GVHD的小鼠外周血中均未检出人B细胞、NK细胞及单核细胞。

2异种移植物抗宿主病的组织学特点

2.1淋巴结及脾脏

免疫组织化学染色显示人CD8⁺细胞较CD4⁺细胞多，主要出现在脾脏白髓^［2］；人B细胞浸润红髓并表达HLA-DR。4周以后脾脏变化最为显著，人细胞以CD3⁺细胞为主并散布在整个脾脏的红髓(以CD8⁺细胞为主)，紧邻脾包膜及脾小梁。这些CD3⁺细胞主要是HLA／DR⁺(30%～80%)，其中很多表达Ki67，仅较少是CD3⁺CD25⁺双阳性。在白髓以CD4⁺细胞为主，可见到Ig⁺细胞。随供者细胞增加，小鼠L3T4⁺及Lyt2⁺细胞明显减少。在GVHD的后期，淋巴结满布供者细胞，绝大多数CD3⁺细胞为CD8⁺，CD4⁺细胞散布在淋巴结内，也可见较多Ig⁺细胞。与供者细胞在脾脏及胸腺的种植相对应，这时受者出现脾肿大。肿大的脾脏内有大量鼠粒细胞标记物阳性的造血细胞，造血干细胞克隆分析显示人和鼠的干细胞并存^［3］，脾脏红髓明显增大，含大量红细胞系及粒细胞系幼稚细胞。有人认为是由于异种GVHD情况下供者增殖的淋巴细胞分泌大量细胞因子刺激受者造血细胞增生所致。

移植后前3周除在骨髓血管腔内偶尔见到供者CD3⁺淋巴细胞外，在骨髓未发现供者细胞。3周后CD3⁺细胞出现并逐渐增加，以CD8⁺HLA⁺为主，也有Ki67⁺细胞，偶有单个的Ig⁺细胞。供者淋巴母细胞在骨髓不仅扩增，还攻击受者细胞。被包围的受者造血细胞区外周可看到细胞稀少、支持组织水肿、局部出血、纤维渗出甚至坏死等病理表现。

2.2胸腺

异种GVHD小鼠胸腺中鼠源性细胞很少，主要以大量人细胞浸润为主。也有研究表明胸腺无人细胞浸润，Murphy等^［3］认为是因人细胞缺乏在该小鼠环境中合适的归巢受体所致，并发现重组人生长激素可促进人细胞进入小鼠胸腺，提示可能还有其它因素影响人淋巴细胞植入小鼠胸腺。

2.3非淋巴器官的表现

术后3周以内均未检出供者细胞。但若经腹腔注射，早期腹膜即可出现供者细胞，并浸润腹腔器官，大网膜及腹腔脂肪内含量最多，可伴发腹水甚至血性腹水。GVHD时肝、肺、胰腺和肾都可观察到供者CD3⁺细胞浸润，肝脏主要位于汇管区及肝小窦，并常进入中央静脉及门静脉。浸润细胞以CD3⁺、CD8⁺、HLA⁺为主，仅极少数为B细胞，也有中性粒细胞，未查到巨噬细胞，细胞浸润同时伴有实质细胞坏死^［4］。肺供者细胞浸润出现在小动脉及小静脉周围，血管腔内可见较多中性粒细胞^［4］，并伴不同程度肺泡内出血。肾脏在肾小管之间及肾孟粘膜下有少量供者细胞浸润，肾小球上有供者的多克隆Ig附着。舌表皮层未发现人细胞^［2、5］。供者细胞的皮肤浸润较少，主要分布在基底层和表皮下，特别是毛囊及其周围。肠道供者细胞的浸润异种GVHD也远远少于同种GVHD^［4、5］，主要在粘膜及粘膜下有少量供者细胞浸润，以CD3⁺、HLA⁺为主，CD8⁺细胞多于CD4⁺细胞。甚至在有的模型中未累及肠道。心脏在异种 gVHD中较少累及。在供者淋巴母细胞浸润部位^［5］，这些细胞攻击周围受者细胞，但在没有靶细胞时则凋亡。尸解可见受损脏器有大量供者细胞浸润并破坏血管结构伴发出血、纤维素性渗出和水肿^［2、5］。因远缘异种动物间与同种动物间靶抗原的分布及表达不同，故通过异种GVHD模型可了解远缘异种动物间异种抗原(特别是超急性排斥抗原以外抗原)的分布、表达强度及免疫细胞对其攻击的特点。

值得注意的是近缘异种GVHD的表现与同种GVHD相仿。

3异种移植物抗宿主病中的效应细胞

已有研究表明异种移植中免疫效应细胞及其作用与同种移植有很大差别，以细胞免疫反应为主的异种GVHD所表现出的特点正好印证了这些差别。在人外周血淋巴细胞(human peripheral blood lymphocyte,hPBLC)鼠移植模型中，多数人认为引起异种GVHD的主要原因为供者T(CD3⁺)细胞^{［2、3、5、6］}。理由是SCID鼠体内存在的绝大多数供者细胞都是T细胞；用抗人T细胞免疫球蛋白干预后GVHD消失；用纯化的人T细胞可诱发GVHD，纯化的B细胞或巨噬细胞则不能；异种骨髓移植时如先去除T细胞则不发生GVHD。Alter的研究发现人T细胞可不依赖抗原递呈细胞帮助，直接识别小鼠MHC分子，但需在有人特异性细胞因子的情况下才可发挥最大作用，故需输入大量淋巴细胞。Murphy等^［3］认为T细胞以CD8⁺细胞为主。也有实验显示T细胞以CD4⁺细胞为主，用CD4抗体可以消除GVHD，CD8抗体则不能。Sandhu等^［6］认为B细胞在异种GVHD中起一定作用，异种GVHD是协同作用的结果，其中至少一部分作用是针对异种抗原的抗体所引起，将去除B细胞的人外周血淋巴细胞移植给SCID鼠后其寿命明显长于不去除组。另外，在hPBLC-SCID鼠血清中也发现较高滴度的抗α-Gal抗体^［7］。关于巨噬细胞及NK细胞在异种GVHD中的作用尚有争议。

4细胞因子与异种移植物抗宿主病

实验证明异种GVHD的发生同样需要众多细胞因子的参与。Huppes等证实在hPBLC-SCID鼠模型中给予白细胞介素2可大幅度减少用于诱发异种GVHD所需的淋巴细胞数量。Bioassay的结果也显示肿瘤坏死因子α、γ干扰素、白细胞介素1、白细胞介素6等细胞因子参与异种GVHD中的“细胞因子级联反应”。由于不同种属间细胞因子的种间差异，使异种GVHD表现出与同种GVHD不同的特点。

5异种移植物抗宿主病与同种移植物抗宿主病的区别

5.1异种GVHD较同种GVHD更难出现^［5］

人-SCID鼠脾细胞移植在同样预处理条件下其GVHD发生率远低于小鼠同种脾细胞移植。Mosier^［8］将(2～5)×10⁷个人外周血淋巴细胞移植给SCID鼠，