中国医学科学院学报2000年第22卷第2期

程小款杜洪震张玉建高军萍衡凤燕吴宁华沈珝琲

摘要目的应用本组制备的白细胞介素2受体(IL-2R)，建立一种既安全又简便，并能定量检测白细胞介素2(IL-2)生物活性的方法。方法采用 Southern 印迹杂交方法，检测重组分泌型 IL-2Rα 亚基(rsIL-2Rα)基因在高效表达的转染细胞基因组中的稳定整合；以 Western 免疫印迹法测定 rsIL-2Rα 的相对分子质量，建立定量检测人 IL-2 生物活性的受体与抗体夹心酶联免疫吸附测定(rELISA)方法。结果(1) Southern 印迹分析表明，rsIL-2Rα 基因已稳定整合到高表达的转染 CHO 细胞基因组中； (2) rsIL-2Rα 的相对分子质量为 40 000 左右； (3) 应用建立的 rELISA 方法测定人 IL-2 标准溶液结果表明， IL-2 的标准曲线范围为 31.25～500.00 U (r=0.9995)；预先将山羊抗人 IL-2 IgG 与 IL-2 保温后，所得标准曲线的斜率明显降低 (P＜0.05)。结论与传统测定 IL-2 的方法相比，用 rsIL-2Rα 建立的受体-抗体夹心 rELISA 方法不仅具有准确、特异性强及操作简便的特点，而且，所得结果直接反映了被测样品中具有结合 IL-2R 活性的 IL-2 的水平。

关键词：分泌型人白细胞介素-2 受体α链酶联免疫吸附法白细胞介素-2

白细胞介素2受体(IL-2R)由 α、β 及 γ 3 种亚基组成，其中 β 亚基也是 IL-15 受体的组成成分，γ 亚基又是 IL-4、IL-7 及 IL-9 受体的组成成分，只有 α 亚基与 IL-2 呈特异性结合，其解离常数为 10^-8 mol/L^［1］。因此，制备重组分泌型 IL-2Rα 链 (rsIL-2Rα) 不仅对研究该蛋白的结构与功能有重要意义，而且，有助于用亲和层析方法纯化 IL-2 及测定人外周血及细胞培养上清中具有生物活性的 IL-2 的水平。本组采用基因工程技术、细胞转染及 G418 筛选建立了一株能分泌高活性 rsIL-2Rα 的中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)细胞株^［2］。本实验对该株细胞中 rsIL-2Rα 基因的稳定整合状态及其表达产物的相对分子质量进行了鉴定，并应用 rsIL-2Rα 建立了定量检测具有生物活性的 IL-2 的受体与抗体夹心酶联免疫吸附法(rELISA)。

材料和方法

材料限制性内切酶为 Boehringer Mannheim 公司产品，寡核苷酸标记试剂盒及 Oligolablling Kit 及低分子量蛋白标准(LWM)均为 Pharmacia 公司产品，［α-³²P］dCTP(1.11×10¹⁴Bq/mmol)购自北京亚辉公司，尼龙膜及硝酸纤维膜为 Bio-Rad 公司产品，超滤器及滤膜 PM10 为 Amico 公司产品，DMEM 培养基、CHO-S-SFM Ⅱ 无血清培养基及 trypsin-EDTA 为 Gibco/BRL 公司产品。

质粒 pCMV/sIL-2R 及表达 rsIL-2Rα 的 ^#17 CHO 细胞株均为本组建立^［2］，重组人 IL-2 (2000 U/μl) 为上海第二军医大学陈克明教授惠赠， IL-2 标准品购自北京市药品检定所，山羊抗人 IL-2 多克隆抗体 IgG 为 R&D 公司产品，辣根过氧化物酶(HRP)标记驴抗山羊 IgG 购自北京中山生物制品有限公司，兔抗人 IL-2Rα 单克隆抗体及 HRP 标记羊抗兔 IgG 均购自北京华美生物工程公司，磷苯二胺(OPD)为北京芳草医药工业公司产品，二氨基联苯胺(DAB)为北京旭东制药厂产品，其它试剂均为国产分析纯。

CHO 细胞培养上清液的收集将已在液氮中保存3年的、表达 rsIL-2Rα 的 ^#17 CHO 细胞株复苏后，先在含 400 μg/ml G418 的 DMEM 培养基中培养 10～14 d，再按 3×10⁵ 个/ml 细胞的密度在无血清培养基 CHO-S-SFM Ⅱ 中继续培养 72 h，离心收集上清，经超滤浓缩 60～100 倍，分装后-20℃保存。

探针的制备质粒 pCMV/sIL-2R 经 Hind Ⅲ 酶切后，回收 0.8 kb sIL-2Rα cDNA 片段，按寡核苷酸标记试剂盒提供的方法用 ［α-³²P］ dCTP 进行标记。

Southern 印迹杂交^［3］首先分别提取 ^#17 CHO 细胞及转染空载体的 CHO 细胞基因组 DNA，经 EcoR Ⅰ 水解后，以 0.7% 琼脂糖凝胶进行电泳，然后将 DNA 转移至尼龙膜上， 68℃ 预杂交 2 h，加入 sIL-2Rα cDNA 探针 (740 Bq/ml)，杂交过夜，再依次用 6×SSC-0.5% SDS、1×SSC-0.5% SDS 及 0.1×SSC-0.5% SDS 洗膜后，进行放射自显影。

Western 免疫印迹^［4］30 μl 细胞培养上清浓缩液经 12.6% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将分离的蛋白转至硝酸纤维膜上。 LMW 蛋白标准用氨基黑染色，样品蛋白经含 5% 脱脂奶粉的 TBS (0.9% NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH7.4) 在 4℃ 封闭，放置过夜或室温放置 2 h 后，以 TBS 洗 3 次(每次 10 min)；再与 1∶40 兔抗人 IL-2Rα 抗体在 37℃ 反应 2 h， TBS 洗 3次后，用 1∶50 HRP 标记的羊抗兔 IgG 反应 1～2 h，再以 TBS 洗 3 次；加 DAB 显色液，室温反应 2～3 min 后观察结果。

rELISA 方法检测 IL-2 的活性向酶标板孔内加 20 μl CHO 细胞培养上清浓缩液和 80 μl 0.05 mol/L 碳酸缓冲液 (pH 9.6)， 4℃ 包被过夜；弃包被液后，再加 200 μl 1% BSA 的 PBS 缓冲液，在 37℃ 放置 2 h后，用 0.05% Tween-20 的 PBS 溶液(PBS-T)洗 3 次(每次 5 min)，然后加 IL-2 标准品或待测样品后，放置 37℃ 2 h 或 4℃ 过夜；再用 PBS-T 洗 3 次，加 100 μl 1∶200 山羊抗人 IL-2 IgG，在 37℃ 反应 2 h， PBS-T 洗 3 次；加 100 μl 1∶500 HRP 标记驴抗山羊 IgG， 37℃ 反应 1～2 h，PBS-T 洗 3 次后，加 100 μl OPD 显色液，避光室温反应 10～15 min，加 50 μl 2 mol/L H₂SO₄ 终止反应后测定光密度(波长 490 nm)。 在特异性抑制实验中，预先将 2000 U IL-2 分别与 10 μg 山羊抗人 IL-2 IgG 及正常山羊血清 IgG 在 37℃ 保温 30 min，稀释成不同浓度，再按上述步骤进行测定。每次每份样品均作双份测定。

结果

rsIL-2Rα 基因在 CHO 细胞中的稳定整合Southern 印迹分析显示，经 EcoR Ⅰ 酶切后的 ^#17 CHO 细胞株 DNA 在 2.3～4.3 kb 之间呈现 3～4 条杂交带，表明 rsIL-2Rα 基因已稳定整合到该细胞株的基因组中(图1)。

图 1CHO 细胞基因组 DNA 与 ［α-³²P］ dCTP 标记的rIL-2Rα 基因的

southern 印迹杂交图谱

fig 1Southern blotting of genomic DNA of CHO cells probed by ［α-³²P］

dCTP-labeled rIL-2Rα cDNA

a. 0.7% agarose gel electrophoresis;B. Southern blot hybridization;

m. λDNA/Hind ⅢP. ^#17 CHO cells;C. CHO cells transfected with mock vector

rsIL-2R 的相对分子质量Western 免疫印迹显示，^#17CHO 细胞培养上清液在相对分子质量 40 000 处出现数条结合带，而转染空载体的细胞上清则未见相应结合带(图2)。

rsIL-2Rα 与 IL-2 结合活性的鉴定采用 rELISA 方法检测含有不同活性单位的人 IL-2 标准溶液，结果显示， IL-2 的标准曲线范围为 31.25～500.00 U (r=0.9995) (图3)，表明 ^#17 细胞株培养上清液具有结合人 IL-2 的生物活性。转染空载体的细胞株培养上清液不能与 IL-2 结合(结果略)。

rsIL-2Rα 与 IL-2 结合特异性预先将 IL-2 与山羊抗人 IL-2 多克隆抗体 IgG 保温后，再与包被了 ^#17 细胞株培养上清浓缩液的酶标板进行 rELISA 测定。结果测得的标准曲线的斜率明显小于未经抗体处理的 IL-2 的标准曲线 (P＜0.05)，而培养上清液与经正常山羊血清 IgG 处理的 IL-2 的结合活性的差异无统计学意义(P＞0.1)(图4)，说明上清液中的 rsIL-2Rα 与人 IL-2 呈特异性结合。

图 2CHO 细胞培养上清液的 Western 免疫印迹杂交图谱

fig 2Western blotting of culture supernatant of CHO cells

a. ^#17 CHO cells;B. CHO cells transfected with mock vector;M. low molecular weight protein standard

图 3rsIL-2Rα-ELISA 方法测定不同活性 IL-2 的结果

fig 3IL-2 activities determined by using rsIL-2Rα-ELISA method

a. development of ELISA，1～6IL-2 content in each well is 0, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 U respectively；B. standard curve of IL-2 activities；OD: optical density