第一军医大学学报1999年第19卷第3期

吕海金大地史占军景宗森郑燕芳马学军

摘要:目的 利用噬菌体表面呈现技术研制高活性、特异性抗骨肉瘤干扰素。方法 将干扰素IFNa 1c/86D DNA插入噬菌体质粒载体pCANTAB5E，并构建噬菌体IFNa 1c/86D AB环突变文库；通过在OS732细胞上竞争性亲合洗脱、MTT法对比检测抗肿瘤活性，筛选针对OS732细胞的高活性噬菌体—IFN突变体。结果 获得2个噬菌体—IFN突变体，其抗OS732细胞增殖活性较突变母体分别提高4和16倍。结论 a 1型干扰素可在噬菌体表面正确折叠表达。这一技术可用于研制高活性特异性IFN。

关键词: 噬菌体表面呈现骨肉瘤人a型干扰素

干扰素（IFN）是一类具有明显的抗肿瘤、抗病毒生物学活性的细胞因子。已有研究证实，IFN对骨肉瘤有明显的抑制作用，但其疗效仍有待提高^[1]。作者利用噬菌体表面呈现(Phage display)技术研制高活性抗骨肉瘤IFN，为临床提高IFN的疗效提供了可能。

1材料和方法

1.1细胞、菌株、载体 骨肉瘤细胞系OS732购自北京积水潭医院骨科；噬菌体载体pCANTAB5E及辅助噬菌体M13K07购自Pharmacia公司；重组质粒pE1028（含IFNa 1c/86D DNA)由中国预防科学院病毒学研究所提供。

1.2引物

p1 CGCTGGCCCAGCCGGCCTGTGATCTCCCTGAGACC （含SfiⅠ酶切位点）

P2 TGACGCGGCCGCTTCCTTCCTCCTTAATCT （含NotⅠ酶切位点）

P3 GGAGGAAGGAGATATCCTGCTCATTG 突变引物（含EcoRⅤ位点）

P4 CTTCTGGAACTGGTTACCATCAAACTCC 突变引物(含BstEⅡ位点)

P5 GTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTC 选择引物

P6 CAAATGAGCAGGATATCTCCTTCCTCCNNKCTGNNKNNKAGACATNNKTTTGG

ATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGTAACCAGTTCCAGAAG 建库模板

P7 CAAATGAGCAGGATATCTCCTTCCTCC 建库PCR引物1 (含EcoRⅤ)

P8 同P4 建库PCR引物2 (含BstEⅡ)

1.3主要试剂 IFNa 1b购于科兴公司；a 1型IFN中和抗体4C1由安徽安科公司惠赠；限制性内切酶及其它工具酶购自BioLabs公司；点突变试剂盒购自Clontech公司；QIAEXⅡ DNA回收试剂盒购自QIAGEN公司。

1.4重组Phage-IFNa 1c的构建 以重组质粒pE1028为模板，用IFNa 1c/86D DNA序列两侧的引物P1和P2 PCR扩增IFN序列。SfiⅠ/NotⅠ酶切后插入pCANTAB5E载体，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，铺SOBAG（100 mg/L氨苄青霉素，2％葡萄糖，下同）琼脂培养板，30 ℃培养过夜。在板上随机挑取6个菌落，提质粒，BglⅡ酶切鉴定出5个阳性克隆（图1）。

图1BglⅡ酶切鉴定重组噬菌体Fig.1Appraisal of recombinant phage

1.DNA markerⅡLane 4(23130,9416,6557, 4361, 2322,2027,564bp); 2.Negative clone，undigested（Lane 6）; 3.Positive clone，digested（Lane1,2,3,5,7）

1.5IFNa 1c/86D AB环突变文库的构建 利用突变引物（P3和P4）和选择引物（P5）引入了两个唯一的酶切位点EcoRⅤ和BstEⅡ，具体操作详见点突变试剂盒说明书。突变库模板（P6，其中对应于氨基酸29，31，32，35位的核苷酸用NNK代替，N代表A、C、G、T；K代表G和T）经引物P4和P7 PCR扩增，EcoRV/BstEⅡ充分酶切后，用QIAEXⅡ系统回收DNA，插入经同样处理的pCABTAB5E-IFNa 1c/86D DNA大片段，2.5kV电转化TG1，铺78.5cm² ×20块LBAG琼脂平板，30℃培养过夜，同时做载体自身连接对照。转入40ml LBAG，扩增至吸光度值（A）约0.5；加入M13K07 2.0×10¹⁰pfu，37℃、100 r/min感染1h，5000r/min离心5min；400ml LBAK（100mg/L氨苄青霉素，50mg/L卡那霉素）悬浮细胞沉淀，30℃ 、300r/min培养12h，离心去除细胞；PEG/NaCl (20% PEG600，14.6% NaCl)沉淀上清中的噬菌体颗粒，以1ml PBS重悬噬菌体沉淀，0.22μm滤膜过滤除菌；部分转化TG1，倍比稀释铺板定量。

1.6在OS732细胞上竞争性亲合筛选Phage-IFN突变体 OS732细胞在12cm²培养瓶中长满后，Hanks液漂洗2遍。加入3ml无血清1640培养基、0.3μg IFNa 1b和5×10¹¹ TU（转导单位）重组噬菌体，37℃孵育1h。弃上清，Hanks液反复漂洗10遍，加入2.5ml无血清1640培养基和30μg IFNa 1b，37℃ 1h后，取50μl上清感染对数生长期TG1，30℃ LBAG琼脂培养板培养过夜。

1.7Phage-IFNa 1c/86D突变体的小量制备 于LBAG培养板上随机挑取40个克隆分别置于5ml LBAG，30℃培养至吸光度值（A）约0.5。

1.8Phage-IFNs抗OS732细胞增殖活性的测定 在OS732细胞上用MTT比色法检测Phage-IFNs抗OS732细胞增殖活性。Phage-IFNa 1c/86D作对照。OS732细胞在96孔培养板上长满80%后，加入倍比稀释的噬菌体IFNs培养72h，MTT染色后，酶标仪测570nm吸光度值。

2结果

2.1重组Phage-IFN突变文库的鉴定 电转化后梯度稀释铺板计数，测得建库克隆数为5×10⁵个，载体自身连接对照为1.5×10²个。pCANTAB5E上没有BglⅡ的酶切位点，IFN DNA上有一个BglⅡ酶切位点，因此用BglⅡ酶切鉴定重组噬菌体pCANTAB5E-IFNa 1c/86D。结果见图1。PCANT-AB5E-IFNa 1c/86D重组质粒被切成一条4.9 kb的单带，阴性克隆未被切开。

2.2Phage-IFNa 1c/86D突变体在OS732细胞上的竞争性筛选 在OS732上竞争性亲合、洗脱，最后得到3 ml含重组噬菌体颗粒的上清，取150μl转化TG1细胞，接种A⁺培养板后，得到98个阳性菌落，从中随机选取40个克隆进行进一步的抗肿瘤活性筛选。

2.3Phage-IFNa 1c/86D突变体抗骨肉瘤增殖活性筛选 分别提取40个重组噬菌体颗粒。MTT比色法检测出10个突变体活性高或等于Phage-IFNa 1c/86D。定量后，再反复用MTT法进行抗骨肉瘤活性筛选，得到2个抗OS732活性最高的突变株─Phage-IFNa 1c/86D OS1和Phage-IFNa 1c/86D OS2。其活性分别高出母体4和16倍。

3讨论

IFNs与受体亲合力的提高常常伴随着活性的提高。体内、体外实验均已证明，IFNs可直接作用于骨肉瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长、增殖^[1,2]。由此，本实验以IFNa 1c/86D基因上的受体结合区为研究对象，通过噬菌体表面呈现技术，以OS732细胞表面的IFN受体为靶目标，研制与OS732细胞有高度亲合力的特异性、高效IFNa 1c/86D突变体。

最近的实验发现^[3]，IFNa 1b的30、33、34位在受体结合区中是高度保守的，而IFN各亚型之间生物学活性的差异极可能是一些非保守区氨基酸的变异造成的。由此推测，a 型IFN AB环中其余4个非保守位点（29、31、32、35位氨基酸）的改变，会导致a 型IFN生物学活性强弱的改变。

在上述研究基础上，我们在建立IFN AB环突变文库时，仅对29、31、32、35四个位点进行了随机突变。电转化建库时的克隆数为5×10⁵个，理论上完全包含了所有4肽库的随机组合（1.6×10⁵个）。此外，我们用自身连接和电转化步骤来确定pCANTAB5E-IFNa 1c/86D突变库是否去除了待替换的小片段，结果发现，重新自身连接的重组噬菌体突变母体只有1.6×10²个，在整个突变体文库中所占比例微乎其微。

我们所选用的IFN母体─IFNa 1c/86D是我国九五期间最新研制的重组干扰素，是中国人的优势亚型^[4]。采用Smith^[5]博士创建的Phage display技术进行突变库筛选，其原理是将外源基因插入某些单链丝状噬菌体外膜蛋白PⅢ和PⅧ基因的末端，使外源基因以融合蛋白的形式表达于噬菌体颗粒表面，同时又不影响重组噬菌体感染和分泌的特性。这样，我们既能在体外直接研究外源蛋白的结构与活性，又可以方便地在众多的噬菌体-外源蛋白突变文库中筛选出我们所需要的靶克隆。作者将IFNa 1c/86D表达于噬菌体—pCANTAB5E的表面，并构建了噬菌体-IFNa 1c/86D AB环突变文库，这种全新的策略可以在大容量的突变库中进行快速、有效的筛选，如同用人工的方法进行自然选择，快速获得更符合需要的突变体。

在噬菌体-IFNa 1c/86D突变体的筛选过程中，我们先将4倍受体封闭量的竞争剂（IFNa 1b）与1倍封闭剂量的重组噬菌体突变库加入细胞培养液，使其与细胞表面受体充分结合。这时可认为与细胞牢固结合的重组噬菌体，表面呈现的是高受体亲合性的或非特异性结合的IFN突变体。充分洗脱后，再加入400倍封闭量的IFNa 1b进行受体竞争，从细胞受体上挤下的高亲合力、特异性结合的重组噬菌体-干扰素。第二阶段，应用MTT比色法，从高亲合力的重组噬菌体干扰素突变体中筛选出高抗骨肉瘤活性的IFNa 1c/86D突变体。

重组噬菌体具有相当的抗骨肉瘤细胞增殖活性，另外，表达于噬菌体表面的IFN还具有正常IFN的抗病毒和免疫学活性（另文报道），表明IFNa 1c/86D是以功能性的正确折