第四军医大学学报1999年第20卷第7期

葛乐韩骅苏成芝陈萍陈梅红

摘要目的:获得特异性抗鼠IgD mAb 414/DF的单链抗体基因.方法：在获得高亲和力抗鼠IgD特异性mAb重、轻链可变区基因的基础上,采用酶连法将二者拼接成单链抗体基因. DNA自动测序仪测定其核苷酸序列,进行计算机酶切位点分析及氨基酸序列推导.结果：所构建的单链抗体基因为V_H-Linker-V_L结构,长729 bp,其中包含重链可变区基因357 bp,可编码119个氨基酸,连接肽基因45 bp, 可编码(Gly₄Ser)₃连接肽，轻链可变区基因327 bp,编码109个氨基酸，含有维持抗体结构所必须的半胱氨酸残基.结论：获得了拼接正确、完整的抗IgD单链抗体基因.

关键词:IgD单链抗体 基因克隆核苷酸序列

0 引言

基因工程抗体技术的不断完善和发展使人们可在基因水平上对已获得的抗体基因进行基因工程改造,将抗体的重、轻链可变区基因用一段连接肽基因连接起来的单链抗体基因具有相对分子质量小,免疫源性低,体内半衰期短,易于基因操作和基因工程大量生产等优点,并能较好保留抗原亲和活性^［1］. IgD在血清中含量很低,属于膜表面免疫球蛋白(sIg),它作为B淋巴细胞表面的重要受体，在识别抗原，激发B淋巴细胞和活化后凋亡以及免疫耐受形成上的重要作用受到越来越多的关注^［2］. 抗 sIg抗体被广泛应用于研究sIg受体在B细胞活化及免疫耐受中的作用，在清除自身反应性B淋巴细胞及治疗相关疾病方面也具有很大的潜在应用价值^［3］. 我们在获得抗鼠IgD特异性mAb重、轻链可变区基因的基础上，用酶连法拼接构建了单链抗体基因，并测定了其核苷酸序列，为其进一步研究应用打下基础.

1材料和方法

1.1材料①pUC19-60Fv:在多克隆位点插入了带有Linker序列(Gly₄Ser)₃的抗黑色素瘤8760单链抗体基因的pUC19克隆载体，由本室王字玲博士构建提供^［4］. ②pUC19-414/DF-V_H和pUC19-414/DF-V_L:分别克隆有抗鼠IgD 414/DF的重、轻链可变区基因的重组质粒载体，其中V_H基因长357 bp，V_L基因长327 bp. ③分子克隆常用各种菌株及质粒载体均为本室保存. 所用各种分子生物学试剂分别购自Promega, Pharmacia, Boehringer Mannheim和华美公司. ④PCR反应仪Minicycler系美国MJ Research 公司产品.

1.2方法

1.2.1V_H基因克隆入pUC19-60Linker-V_L载体将pUC19-60Fv及pUC19-414/DF-V_H均以EcoRⅠ和BstEⅡ酶切消化，电泳回收后连接载体pUC19-60Linker-V_L及插段V_H,连接物转化E.coli DH5α感受态细胞，从转化板挑取单菌落，37℃培养过夜，碱裂解法提取质粒DNA，经EcoRⅤ,HindⅢ双酶切筛选出含414/DF-V_H的重组克隆.

1.2.2带SacⅠ酶切位点的V_L基因的PCR扩增按照已知的V_L 5′端序列设计了带SacⅠ酶切位点的PCR引物P1,V_L 3′端引物P2由本室杨安钢教授设计^［5］,中国科学院上海生物工程研究中心合成. 以pUC19 414/DF-V_L为模板，反应条件为：94℃ 50 s, 55℃ 1 min, 72℃ 1 min,共进行40次循环. 引物序列为：

P1 5′-GTGAGCTCATGGACATTGTGATGA

CCCAGTCTCC-3′

P2 5′-CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCA

GCTTGGTCCC-3′

1.2.3V_L基因克隆入重组载体获得414/DF单链抗体基因PCR产物经电泳回收后，以SacⅠ和SalⅠ消化，然后克隆入经SacⅠ,SalⅠ 酶切下60V_L基因片段的pUC19-414/DF-V_H-Linker载体. 连接物转化大肠杆菌感受态细胞. 提质粒后 EcoRⅠ和KpnⅠ酶切鉴定获得60V_H,60V_L均被置换出来了的重组克隆. 进行酶谱分析,初步确定为插入414/DF单链抗体的pUC19-414/DF-scFv.

1.2.4核苷酸序列测定大量提取质粒pUC19-414/DF-scFv,经FPLC Q柱纯化后,取2 μg为模板,荧光标记引物,用美国PE317A型DNA自动测序仪进行核苷酸序列测定.

2结果

2.1414/DF-V_H基因的置换将pUC19-60Fv及pUC19-414/DF-V_H均以EcoRⅠ和BstEⅡ酶切消化，制备除去60V_H的pUC19-Linker-V_L载体 及414/DF-V_H插段,电泳回收后连接载体与插段，转化大肠杆菌感受态. 经蓝白筛选，随机挑选6个白色克隆，小量提取质粒后经EcoRⅤ,HindⅢ酶切鉴定，能切出670 bp大小片段者为60V_H被置换出来的重组克隆(Fig 1).

图 1含414/DF-V_H的pUC19重组克隆的筛选

fig 1Screening of 414/DF-V_H recombination clones

1～6: Digestion of recombinant pUC19-414/DF-V_H with EcoRⅤ plus HindⅢ; M: pGEM-7zf/HaeⅢ.

2.2带SacⅠ酶切位点的414/DF V_L基因的扩增用P1和P2引物扩增414/DF的V_L基因，琼脂糖凝胶电泳观察到330 bp大小的特异条带，用Glassmilk回收.

2.3V_L基因克隆入重组载体获得414/DF scFv基因 将PCR产物经SacⅠ, Sal Ⅰ双酶切后,克隆入 经Sac Ⅰ, Sal Ⅰ消化去除60V_L的pUC19-414/DF-V_H-Linker载体中，并转化DH5α感受态细胞. 在转化板上挑选6个白色克隆，提取质粒EcoRⅠ和KpnⅠ酶切鉴定，有520 bp小片段的为60V_H,60V_L均被置换出来的重组克隆(Fig 2),并进行酶谱分析证实.

图 2pUC19-414/DF-scFv克隆的筛选

fig 2Screening of pUC19-414/DF-scFv

1～6: Digestion of recombinant pUC19-414/DF-scFv with EcoRⅠ plus KpnⅠ; M: pGEM-7zf/HaeⅢ.

2.4414/DF单链抗体基因的核苷酸序列挑选1个阳性克隆大量提取质粒，经FPLC Q柱纯化后测序，得到拼接正确的414/DF的单链抗体基因序列(Fig 3). 结合计算机酶切位点分析及氨基酸序列推导,认为所构建的单链抗体基因为V_H-Linker-V_L型结构,长729 bp,其中包含重链可变区基因357 bp,可编码119个氨基酸,连接肽基因45 bp, 可编码(Gly₄Ser)₃连接肽结构，轻链可变区基因327 bp,编码109个氨基酸，含有维持抗体结构所必须的半胱氨酸残基. 得到了拼接正确、完整的414/DF单链抗体基因.

图 3V_H-Linker-V_L基因拼接点序列

Fig 3Sequence of fusion junction of V_H-Linker-V_L

3讨论

单链抗体基因的拼接方法，如PCR克隆法，PCR基因合成法，寡核苷酸突变法，以及近几年较普遍采用的全套抗体噬菌体表面呈现技术，存在着成本高或在PCR过程中易产生碱基的错配等缺点. 我们采用的酶连法是我室在基因工程抗体研究中摸索出来的一种新方法. 这种方法就是利用一个构建好的带有单链抗体基因的pUC19 克隆载体，经限制性内切酶酶切消化及两次亚克隆，分两步完成重、轻链可变区基因的置换，而将连接肽序列保留，从而构建V_H-Linker-V_L型单链抗体基因. 本方法较以往的构建单链抗体基因的方法具有成本低、基因拼接准确等优点，尤其适于经杂交瘤途径已获得抗体的重、轻链可变区基因序列后基因工程单链抗体的拼接工作.

影响免疫耐受机制形成及B细胞克隆清除的因素是近年免疫学研究的一个热点. 也有研究认为自身反应性B淋巴细胞的克隆清除异常及免疫耐受机制的破坏是自身免疫性疾病发病的关键所在. 而抗sIg抗体与B淋巴细胞表面sIg的交联可干扰免疫耐受过程，并可导致成熟B淋巴细胞的凋亡，称之为B细胞的外周清除^［6，7］. 由于IgD在血清中含量极低，抗IgD抗体因无被血清中相应Ig中和之忧，而显示出良好的体内研究及应用前景. 本实验利用酶连法，将高亲和力特异性鼠抗鼠IgD单克隆抗体的轻、重可变区基因成功地拼接为单链抗体基因，序列分析表明可编码正确的小鼠单链抗体，其表达及活性检测工作正在进行中.

作者简介:葛乐,女,1965-10-12生,天津市人,汉族. 1989年第四军医大学毕业,1998年获生物化学博士. 现为第四军医大学西京医院肿瘤科主治医师. 电话:(029)3375431

作者单位：第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033

参考文献