第四军医大学学报1999年第20卷第7期

陈萍邓健蓓药立波韩骅苏成芝

摘要目的:RT-PCR法获得鼠抗人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)单克隆抗体E6轻、重链可变区基因序列,分别构建融合表达载体pGE6VH和pGE6VL，利用大肠杆菌系统表达VH和VL单域抗体蛋白.方法:将RT-PCR法获得的E6VH和E6VL基因分别克隆入融合表达载体pGEX4T-1中,使它们受控于Ptac启动子, 转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,100 g/L SDS-PAGE检测表达产物.结果:SDS-PAGE显示E6VH表达产物分子质量约为38 ku,E6VL表达产物分子质量约为37 ku,与预期结果相符. 光密度扫描结果表明,谷胱甘肽巯基转移酶（GST）-VH融合蛋白占菌体总蛋白的45%,GST-VL 融合蛋白占菌体总蛋白的36%,Western-blot证实在相应分子质量处,有GST-VH和GST-VL融合蛋白的显色条带.结论:在大肠杆菌DH5α中成功地表达了hTNF-α的单域抗体基因.

关键词：肿瘤坏死因子融合表达单域抗体谷胱甘肽巯基转移酶

0引言

E6为分泌鼠抗人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)mAb的杂交瘤细胞株, 由我校免疫学教研室制备建株, 抗体分泌量(腹水)约为15 g/L, 所分泌的hTNF-α mAb具有较强的体内中和活性^［1］,在预防和治疗由于hTNF-α过量产生而引起的炎症、恶液质及自身免疫性疾病等方面具有重要的临床应用价值. 为避免鼠源性mAb作为异种蛋白在人体内使用的各种弊病^［2］,我们在用RT-PCR法扩增获得抗hTNF-α mAb功能性重排的轻、重链可变区基因的基础上^［3］,将VH和VL 基因分别克隆入谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione s-transferase,GST)融合表达载体pGEX4T-1,在大肠杆菌DH5α中高效地表达了抗hTNF-α的单域抗体,为进一步研究其抗原结合活性和基因工程抗体的改造创造了条件.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1杂交瘤细胞株E6分泌鼠抗hTNF-α mAb,IgG1/κ型,抗体分泌量(腹水)约为15 g/L,由我校免疫学教研室制备建株.

1.1.2质粒和菌株pUCE6VH质粒,在pUC19酶切位点EcoR I至Sal I之间插有分泌鼠抗hTNF-α mAb E6的重链可变区基因, 长351 bp, Amp^R, 半乳糖苷酶(LacZ)基因插入失活. pUCE6VL质粒,在酶切位点EcoR I＋Sal I之间插有分泌鼠抗hTNF-α mAb E6的轻链可变区基因,长321 bp,Amp^R, LacZ基因插入失活. pGEX4T-1表达载体,全长4 969 bp, 为含GST的融合蛋白表达载体,Ptac 启动子,Amp^R,GST基因后接59 bp多克隆位点,含3个读框终止码,GST 与目的基因产物之间有凝血酶识别位点. E.coli DH5α菌株,基因型supE44ΔlacU169(φ80lacZΔM15)hsdR17recA1 endA1 gyrA96 thi-relA1.均为本室保存.

1.1.3主要试剂和仪器各种限制性内切酶为Boehringer公司产品；IPTG为Sigma公司产品；核酸分子质量Marker和低分子质量标准蛋白购自华美公司；电泳转移系统为Bio-Rad公司产品；薄层扫描仪CS-9000为岛津公司产品.

1.2方法

1.2.1重组表达质粒的构建将分别含有E6VH，E6VL基因的pUC19重组质粒pUCE6VH和pUCE6VL分别用EcoR I ＋Sal I双酶切,电泳回收VH、VL基因片段后,分别与用EcoR I， Sal I双酶切开并电泳回收的pGEX4T-1载体连接, 构建成GST融合表达载体pGE6VH和pGE6VL，pGE6VH，pGE6VL分别转化E.coli DH5α感受态细胞,在含Amp的LB琼脂板上37℃培养过夜,挑取单菌落, 碱裂解法小量提取质粒DNA. EcoR I＋Sal I酶切后电泳筛选分别含E6VH、E6VL基因插段的重组克隆.

1.2.2E6VH，E6VL 基因的诱导表达取过夜培养的阳性克隆菌种,按10 mL/L转接2 mL含Amp的LB液中,37℃振荡培养3 h左右（A=0.6）,加入0.1 mmol/L IPTG 4 μL,37℃振荡培养4 h,取1.5 mL菌液离心收集菌体,加20 μL H₂O重悬菌体后,再加20 μL 2×上样缓冲液( 0.125 mol/L Tris.Cl pH 6.8，100 mL/L甘油，40 mL/L SDS，4 mL/L β-硫基乙醇，0.2 mL/L溴酚蓝),混匀,煮沸10 min,离心（10 000 g）10 min,备用.

1.2.3SDS-PAGE配制120 mL/L分离胶和30 mL/L浓缩胶,按Bio-Rad公司蛋白电泳系统的说明书灌制凝胶, 取上述样品上样,每孔5μL,电泳缓冲液为25 mmol/L Tris.Cl，250 mmol/L 甘氨酸，1 mL/L SDS pH 8.3,恒压100 V,电泳1.5 h,凝胶浸泡于考马斯亮蓝染液(500 mL/L异丙醇，2.5 mL/L 考马斯亮蓝R250，700 mL/L冰醋酸)中染色1 h～2 h,脱色液(200 mL/L乙醇，70 mL/L冰醋酸)脱色并观察.

1.2.4凝胶扫描定量用CS-9000薄层扫描仪在580 nm波长下扫描SDS-PAGE蛋白条带.

1.2.5Western-blotSDS-PAGE结束后,按Bio-Rad产品说明书,100 V电压,1 h～2 h,将凝胶电转移至硝酸纤维素(NC)膜上,转移缓冲液为25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，200 mL/L甲醇. 电转移后NC膜浸入10 mL/L封闭液中,4℃封闭过夜,加1∶1 000 GST mAb,37℃温育4 h, 以TBST(TBS-10 mL/L Triton X-100)室温洗膜3次,再加入10 mL/L封闭液稀释的碱性磷酸酶(Ap)标记的鼠抗羊IgG, 37℃温育反应1 h,洗膜3次,加入底物反应液,室温30 min内呈色观察.

2结果

2.1构建成单域抗体表达载体分别从pUCE6-

vH，pUCE6VL中用EcoR I＋Sal I切出E6VH，E6VL基因,重组入表达载体pGEX4T-1中,分别构建成GST融合表达载体pGE6VH和 pGE6VL,经PCR扩增筛选出含有354 bp VH和含有321 bp VL插段的阳性克隆（Fig 1）.

1pGE6VH和pGE6VL 阳性克隆的PCR筛选

Fig 1Identification of pGE6VH and pGE6VL

1,2. pGE6VH; 3. pGEM7zf(+)/Hae Ⅲ; 4,5. pGE6VL.

2.2单域抗体基因的诱导表达将pGE6VH和pGE6VL过夜培养的阳性克隆菌种,按10 mL/L分别转接2 ml含Amp的LB液中,经37℃振荡培养,IPTG 诱导4 h后, 120 mL/L SDS-PAGE检测表达情况,pGE6VH经IPTG诱导者与未诱导者相比,在约38 ku处有一明显深染新生蛋白条带, pGE6VL经IPTG诱导与未诱导者相比,在约37 ku处有一明显深染新生蛋白带,与预期的GST-E6VH和GST-E6VL融合蛋白大小相符(Fig 2).

图 2pGE6VH和pGE6VL诱导表达后的SDS-PAGE 结果

Fig 2SDS-PAGE of expressed pGE6VH and pGE6VL from E.coli

1,3. Induced pGE6VL; 2,4. Non-induced pGE6VL; 5. Protein molecular mass standards; 6. Induced pGE6VH; 7. Non-induced pGE6VH; 8. Induced pGEX4T-1; 9. Non-induced pGEX4T-1.

2.3单域抗体基因的表达量用岛津公司CS-9000薄层扫描仪证实,GST-E6VH表达量占菌体总蛋白的45%, GST-E6VL表达量占菌体总蛋白的36%(Fig 3).

图 3GST-E6VH和GST-E6VL的表达量

fig 3The amount of expression of GST-E6VH and GST-E6VL by thin scanning

2.4Western-blot结果 pGEX4T-1载体经IPTG诱导后，行Western blot在约25 ku处有较深的显色印迹, pGE6VH及pGE6VL Western blot分别在38 ku,37 ku处有较深的显色印迹,虽然Western blot显色时有非特异条带出现,但是37 ku～38 ku条带是最强的,并且不出现于未诱导的菌体蛋白中,说明它们是与GST 抗体特异性结合的GST-VH和GST-VL融合表达蛋白（Fig 4）.

图 4pGE6VH和pGE6VL的 Western blot

fig 4The Western blot of pGE6VH and pGE6VL

1. pGE6VH； 2. pGE6VL.

3讨论

单域抗体(single domain antibody),由单一VH或单一VL组成,其分子大小是完整抗体的十二分之一,由于VH或VL单独存在，其表面疏水性很大，抗原亲和力也比亲本mAb为弱. Ward等^［4］于1988年首次在大肠杆菌中表达了抗溶菌酶抗体D1.3的VH区,近年来Cai等^［5］和邓健蓓等^［6］也成功地在噬菌体表面呈现表达了单域抗体基因. 用基因工程方法将VH和VL基因在原核细胞中表达而获得单域抗体, 可作为构建各种基因工程抗体的基本元件,且单域抗体由于分子量小,更为容易地透过细胞膜进入靶组织，具有一定的应用价值,在临床诊疗中前景诱人.

我们选用了融合表达载体pGEX4T-1, 在大肠杆菌DH5α中经IPTG诱导成功地表达了GST-E6VH和GST-E6VL融合蛋白,并获得较高水平的表达. 将分子质量较小的VL，VH基因以融合蛋白形式表达,可增强mRNA及表达产物的稳定性. 再者融合蛋白是避免蛋白酶切破坏的最好措施,且可达较高表达水平, 还可利用GST作蛋白标签进行检测和纯化,为后续的纯化工作奠定了良好的基础. 另外VL，VH表达量<