吴兴安徐志凯姜绍谆阎岩白文涛王海涛张芳琳薛小平

第四军医大学学报1999年第20卷第7期

吴兴安徐志凯姜绍谆阎岩白文涛王海涛张芳琳薛小平

摘要目的：构建人源性Fab噬菌体抗体基因库并筛选可表达与肾综合征出血热（HFRS）病毒抗原特异结合之Fab抗体的重组克隆.方法：利用逆转录、聚合酶链反应（PCR）等技术从HFRS恢复期患者外周血淋巴细胞（PBL）中扩增出人IgG抗体重链Fd基因及κ轻链基因，将之克隆入噬菌体载体pComb3，构建人源性Fab噬菌体抗体基因库. 并利用噬菌体表面呈现技术，对此抗体库进行淘筛、富集.结果：①成功地构建了人源性Fab抗体基因库，库容量为3×10⁶. ②从噬菌体抗体库中淘筛得到了能表达人源性抗HFRS病毒Fab抗体的重组克隆.结论：利用噬菌体抗体库技术，可以获得能表达人源性抗HFRS病毒抗体的重组克隆.

关键词:肾综合征出血热病毒聚合酶链反应Fab基因噬菌体呈现技术

0引言

肾综合征出血热（HFRS）在我国是危害最严重的急性病毒性传染病之一，目前尚无特异有效的治疗方法，而鼠源性mAb的应用又具有一定的局限性. 本世纪90年代出现了噬菌体抗体库技术^［1］，用基因工程的方法制备人源性mAb已日趋成熟，它可以克服用传统的杂交瘤技术制备人源性mAb所遇到的一些难题，如融合率不高，杂交瘤不稳定，抗体产量低等. 获得人抗体基因并构建足够库容量的抗体基因库是利用噬菌体抗体库技术制备人mAb的关键. 我们参照文献［2，3］设计了一组扩增人抗体重链Fd基因及κ轻链基因的引物，从HFRS恢复期患者外周血淋巴细胞（PBL）中扩增出了重链Fd基因及κ轻链基因^［4］, 并成功地构建了库容量为3×10⁶的Fab抗体基因库，利用噬菌体表面呈现技术对此抗体库进行数次淘筛富集，获得了能表达与HFRS病毒抗原特异结合之Fab抗体的阳性克隆.

1材料和方法

1.1菌株、质粒及mAb大肠杆菌XLI-Blue,辅噬菌体VCSM13，噬菌体载体pComb3,由中国预防医学科学院病毒所梁米芳研究员及第三军医大学万泽生博士惠赠，鼠源性抗HFRS病毒mAb 1A8及HFRS病毒特导性抗原由本室自制.

1.2方法

1.2.1人PBL的分离及cDNA第一链的获得采取HFRS恢复期患者血清，用ELISA 法测得其血清中抗HFRS病毒IgG抗体阳性，用淋巴细胞分离液按常规法分离人PBL，然后用Gibco公司的Trizol Reagent提取淋巴细胞的RNA，并用Promega公司的Reverse Transcription System逆转录得到cDNA第一链. 具体方法均参照其说明书进行.

1.2.2重链Fd基因及κ轻链基因的扩增首先参照文献［2，3］设计用于扩增人抗体重链Fd基因及κ轻链基因的引物，其序列如下：

huHL1:5′-ATGGACTGGTCCAGGAG(GC)

(GTA)TC(CT)T(CT)T-3′

huHL2:5′-ATGGAG(CT)T(GT)GGGCTG

aGCTGG(GAC)TTTT-3′

huHL3:5′-ATGAAACA(TC)CT(GT)TG(GT)(TC)TC(AT)TC(CT)T(TC)CT-3′

huCHs:5′-AGCACTAGTTTTCTTGTCCACCT

tGGTGTTGCTGGGCTT-3′

huB1X:5′-CAGCTCGAGCAGTCTGG(AG)

gC(AT)GAGGTG-3′

huB3X:5′-CAGCTCGAGGAGTCTGGGGGAG-3′

huKL1:5′-ATGAGG(GC)TCC(TC)(TC)(AG)

cTC(AT)GCT(CT)CTGGGG-3′

huKL2:5′-ATGGAA(AG)CCCC(AC)(AG)

(AG)C(GT)CA(GC)(GC)T(TC)(TC)TC-3′

hvKBs:5′-CAGCCATGGCCGAGCTCAC(GC)C

aGTCTCC-3′

hucKXb:5′-GCCGTCTAGAATTAACACTCT

cCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAA

cTCAGGCC-3′

HuHL1,HuHL2,HuHL3为重链前导肽引物，HuCHs为重链恒定区1（CH1）引物，HuB1X,HuB3X为重链框架区1（FR1）引物. HuKL1,HuKL2为κ轻链前导肽引物，HvKBs为κ轻链框架区1（FR1）引物，HucKXb为κ轻链恒定区（CK）引物，引物均含简并码. 取上述逆转录反应液5 μL，用重链前导肽引物和CH1引物配对进行PCR，然后用重链FR1及重链CH1引物配对做第二轮PCR扩增Fd基因. 同理，用轻链前导肽引物和CK引物配对做PCR，再用轻链FR1区及CK引物做第二轮PCR扩增κ轻链基因. 半套式PCR反应条件如下：反应体积100 μL，每端引 物加45 pmol,94℃,1 min,50℃,1 min，72℃,1.5 min扩增35个循环.

1.2.3人抗体重链Fd基因及κ轻链基因库的构建用XhoⅠ及SpeⅠ将扩增的重链Fd基因克隆入噬菌体抗体表达载体pComb3上，命名为Fd-pComb3，得到Fd基因库. 挑取单菌落, 提质粒后用XhoⅠ+SpeⅠ酶切鉴定是否有目的片段Fd基因插入. 用XbaⅠ及SacⅠ酶切位点将扩增的κ轻链基因再克隆至Fd基因库的相应位点，命名为Fab-pComb3，得到Fab抗体基因库. 同样挑取单菌落，提质粒后用Xho Ⅰ+Xba Ⅰ酶切鉴定是否有Fd基因和轻链基因插入.

1.2.4噬菌体抗体库的制备及淘筛在上述Fab抗体基因库中加入10¹² pfu(噬斑形成单位)的辅噬菌体VCSM13, 超感染后制备成噬菌体抗体库. 噬菌体抗体库的淘筛及特异性富集基本参照文献［5］. 用鼠源性抗HFRS病毒mAb 1A8 包被酶联板，加HFRS病毒特异性抗原，再加入上述噬菌体抗体库，37℃孵育。特异性吸附的噬菌体洗脱后再感染新鲜的XLI-Blue菌，经VCSM13超感染后进行下一轮淘筛，如此反复筛选4轮以后，计算阳性与阴性对照的比例. 从中挑选30个单菌落，加VCSM13超感染制备上清，用ELISA 夹心法检测其与HFRS病毒特异性抗原的结合活性，检测方法基本同淘筛，酶标抗体用HRP-抗M13.

2结果

2.1PCR扩增人抗体重链Fd及κ轻链基因用设计的引物对人PBL的cDNA第一链进行PCR扩增，得到约660 bp左右的人抗体重链Fd基因及κ轻链基因^［4］（Fig 1）.

图 1人抗体Fd基因及轻链基因PCR产物

fig 1The PCR products of heavy chain Fd genes and light chain genes of human antibody

1: DNA markers,PGEM7zf(+) Hae Ⅲ; 2: Fd genes；3: κ genes.

2.2人抗体Fd基因库的构建及酶切鉴定将扩增产物约660 bp的Fd基因克隆入噬菌体载体pComb3^［5］，命名为Fd-pComb3，得到Fd基因库，库容量为5×10⁵，挑单菌落提取质粒，经XhoⅠ+SpeⅠ酶切鉴定，6个菌落提取的质粒中有4个可切出660 bp左右片段，即为插入的目的片段Fd基因（Fig 2），克隆效率为66%.

2重组质粒pComb3-Fd酶切鉴定

fig 2Identification of recombinant plasmid pComb3-Fd enzyme digestion

1: DNA markers,PGEM7zf(+) Hae Ⅲ; 2,3,5,6: Positive clones; 4,7: Negative clones.

2.3人源性Fab抗体基因库的构建及酶切鉴定将κ轻链扩增产物克隆至Fd基因库的相应位点,命名为Fab-pComb3，得到Fab抗体基因库，库容量为3×10⁶. 挑单菌落提取质粒，经XhoⅠ+XbaⅠ酶切鉴定，从10个菌落中提取的质粒中有4个可切出 2.2 kb 左右片段，即有目的片段Fd基因及轻链基因插入(No.3,4,5,10)，克隆效率约为40%，其中3个只有Fd基因插入(No.2,7,8). 3个是空载体pComb3(No.6,11,12)（Fig 3）.

3重组质粒pComb3-Fab 酶切鉴定

Fig 3Identification of recombinant plasmid pComb3-Fab by enzyme digestion

1,7: DNA markers,λ DNA/EcoRⅠ+HindⅢ; 3,4,5,10: Positive clones; 2,6,8,9,11,12: Negative clones.

2.4噬菌体抗体库的淘筛与鉴定将制备的噬菌体抗体库经过4轮淘筛后，其阳性与阴性对照的比例增加了约200倍. 随机挑取30个克隆, 超感染制备噬菌体抗体上清，用ELISA夹心法检测其与HFRS病毒抗原的结合活性，其中6个克隆为阳性（以P/N值＞4判为阳性），用正常鼠脑抗原、ELLSA洗液作为对照,均不与这些克隆的上清液反应，其A_{490 nm}值如Tab 1. 表明这些噬菌体抗体具有特异性结合HFRS病毒抗原的活性.

表 1抗HFRS病毒噬菌体抗体的A_{490 nm}值

tab 1A_{490 nm} of phage antibodies against HFRS virus