第三军医大学学报1999年第21卷第11期

唐康来杨柳卢卫忠吴梅英成小玲倪兵曹佳

提要目的：建立一种快速、简单、实用的从人血小板提纯转化生长因子β(TGF β)的方法。方法：改良的白膜回浆法提取人血小板，酸醇抽提裂解法提取血小板中的TGF β及2次凝胶过柱法纯化TGF β。所有提取及纯化步骤均在酸性条件下进行以防止管壁对TGF β的吸附和生物活性的影响；使用了易挥发的溶媒和缓冲液便于冻干时去除。结果：SDS-PAGE电泳及薄层分析显示纯化后的TGF β纯度达到89.38%，在EGF参与下10ng/ml浓度的TGF β可刺激NRK细胞在软琼脂培养中呈多克隆样生长。结论：运用本方法提取的TGF β纯度高，生物活性强；与以前方法相比具有成本低廉、提取工艺简单、快速实用的特点。

关键词：转化生长因子β提取与纯化血小板人

转化生长因子β(Transforming growth factor β，TGF β)可能是目前所知的作用最为复杂和多样的生长因子,在骨折愈合、软组织创伤修复、器官移植和肿瘤治疗等多学科领域具有广阔的临床应用前景^［1～6］。而影响TGF β临床应用的最大障碍之一是TGF β来源有限,且价格非常昂贵。目前TGF β的制备主要有2种方法：①从生物组织细胞中直接提取纯化；②利用转基因技术在部分真核细胞中高效表达，然后分离纯化；而转基因技术难度大，其产品稳定性差，仅限于实验室探索阶段，暂无法运用推广^［7］；因此直接从生物组织细胞中提取纯化TGF β仍是目前最为有效的方法。如何降低制备成本，提高TGF β产率，建立一种快速稳定的并能规模化生产的方法意义特别重大。本实验通过摸索成功地建立了一种快速简单的从人血小板中提取纯化TGF β的方法。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

Pepstatin 胃酶抑素(Sigma公司),苯甲基磺酰氟PMSF (Sigma公司), 表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)(由西南医院烧伤研究所惠赠),超纯脲(Sigma公司), 正常鼠肾细胞(Normalrat kidney,fibroblasts,NRK)(中科院上海细胞生物所),标准分子量蛋白(华美公司),Bio-GelP60生物凝胶(Bio-Rad公司),色谱柱(上海华美实验仪器厂),细胞破碎仪(上海华美实验仪器厂),紫外检测记录仪(Bio-Rad公司),2132型蠕动泵 ,垂直电泳仪(大连高新技术开发公司),CO₂孵箱,高速冷冻离心机（Beckman）,冻干机,人TGF β-ILISA试剂盒(美国Gezyml公司),CS-9000全自动薄层分析仪(Beckman)，人血（由西南医院输血科提供）。

1.2人血小板分离

取新鲜ACD-B抗凝人全血200 ml×30袋,室温下离心(2500×g)12 min，分层后回收血浆，将血袋中间约20～30 ml白膜层和约10～20 ml上层红细胞一并挤入100 ml空血浆袋；充分混匀后，进行第2次离心(500×g,6 min)，分出上层浓缩血小板血浆。再进行重离心(3200×g，4℃，30 min)，回收上部血浆进行再利用。收集的血小板用PBS缓冲液洗脱两次(3200×g，4℃，30 min)，收集纯的血小板进行下面的实验。

1.3人血小板TGF β粗提

按每克血小板加入4ml已配制好的酸醇抽提裂解液（其组成成分为375 ml 95％乙醇和7.5 ml浓盐酸加入33 mg PMSF和1.9 mg Pepstin)，振摇3～5min后立即用匀浆器匀浆，4℃隔夜孵育。离心(3200×g，4℃，30 min)去除杂质，收集上悬液，加入氨水(NH₄OH)调PH到3，再加2倍体积乙醇(4℃)和4倍体积乙醚(4℃) 于上悬液中予以萃取，4℃隔夜孵育。血小板蛋白沉淀后，予以离心(3200×g,4℃,30 min)收集沉淀，并用1 mol/L乙酸溶液溶解，4℃隔夜孵育。再次离心去除未溶解的杂质，得到粗提产品溶液，予以冻干(-20℃)保存。

1.4TGF β的纯化

用1mol/L乙酸溶液溶解粗提物，低压液相色谱柱(3.0 cm×120 cm)层析，充填物为Bio-GelP60，平衡液及洗脱液为1mol/L乙酸，流速16.8 ml/h，收集部分为每管4.2ml；用凝胶电泳(SDS-PAGE)确定TGF β活性峰，收集TGF β活性峰高的部分，冷冻干燥，电泳及薄层分析测其含量。将冻干的活性峰部分溶于1mol/L的乙酸溶液(含8mol/L超纯脲)，再一次行低压液相色谱柱(2.6 cm×100 cm)层析，充填物仍为Bio-Gel P60，洗脱液为1mol/L乙酸(含8mol/L超纯脲)，流速为10 ml/h，收集部分为每管2.5 ml；同样用凝胶电泳确定TGF β活性峰，收集TGF β活性峰高的部分，用1mol/L乙酸溶液透析去脲，冷冻干燥。

1.5检测方法及生物活性测定

1.5.1SDS-PAGE凝胶电泳取粗提物、第1、2次纯化层析曲线蛋白峰部分及2次冻干产品行SDS-PAGE电泳；浓缩胶为5%，分离胶为15%，按文献的方法^［8］进行电泳，电泳结束后用考马斯亮蓝法染色，电泳用标准蛋白Marker的分子量分别为97.4×10³u,66.2×10³u，43×10³u,31×10³u,20.1×10³u,14.4×10³u以及25×10³u的TGF β标准蛋白。

1.5.2薄层分析将上述SDS-PAGE结果在CS-9000 全自动薄层扫描仪上进行薄层分析，测定粗提物、初步纯化及第2次纯化的样品中蛋白组成及TGF β含量。

1.5.3ELISE法定量按美国Genzyme公司提供的人TGF β的ELISA试剂盒所标说明书进行测定，测出待测样品和标准品OD值,绘制标准曲线。根据OD值算出其样品的浓度,再根据其浓度和体积算出样品的TGF β总量。

1.5.4生物活性鉴定方法将3％软琼脂17 ml加热至45℃让其融化,混入83 ml 37℃的PRMI 1640培养液(含15％胎牛血清)配成A液，按每孔1 ml加入6孔培养板。用0.25％胰蛋白酶消化贴壁的NRK细胞，再用PRMI 1640培养液洗脱2次(不含胎牛血清)，将NRK细胞混悬于含有15％胎牛血清的PRMI 1640培养液配成B液并予计数。将B液接种于含有A液的6孔培养板内，使NRK细胞的含量为5000/孔，容积为2.5 ml，置于4％CO₂孵箱孵育(37℃)5 d。实验共分4个组：①TGF β组(TGF β的终浓度为10ng/ml)；②TGF β＋EGF组（TGF β终浓度为10 ng/ml，EGF终含量为2.5 ng/ml)；③EGF组(EGF组终含量为2.5 ng/ml)；④空白对照组。

2结果

2.1人血小板提取率及纯度

随机对其中8个200 ml ACD-B抗凝人全血提取前后对比测定，血小板提取率均在70％以上，红细胞和白细胞混入量均小于2.0×10⁸/袋和1.4×10⁸/袋。

2.2TGF β粗提物的分析结果

SDS-PAGE电泳和薄层分析显示，见图1。TGF β粗提物成分复杂，至少有13种以上不同分子量的蛋白成分，以25×10³u成分和低分子量的蛋白最多，其中25×10³u的TGF β含量为33.05%；超过25×10³u成分约占18%以上。

图1TGF β粗提物SDS-PAGE凝胶电泳结果

左:标准蛋白;右:TGF β粗提物

Fig 1SDS-PAGE of crude TGF β

Left: Protein markers; Right: Crude TGF β

2.3TGF β 2次纯化分析结果

2.3.1第1次纯化分析结果TGF β粗提物经Bio-Gel P60(洗脱液为1mol/L乙酸)柱层析曲线；SDS-PAGE显示第75～96管部分中含有25×10³u成分。SDS-PAGE凝胶电泳及薄层分析结果:第1次纯化收集的TGF β，以25×10³u和小分子量的蛋白为主，其中25×10³u的TGF β含量为67.34%；大分子量的蛋白含量低。

2.3.2第2次纯化分析结果第1次纯化的TGF β再次经Bio-Gel P60柱层析(洗脱液为1 mol/L乙酸，8 mol/L超纯脲)曲线，仅见一个吸收峰；SDS-PAGE显示第105-114管部分中含有25×10³u成分。SDS-PAGE凝胶电泳及薄层分析结果：第2次纯化收集的TGF β以25×10³u的TGF β为主，其中仍见少许的低分子量蛋白成分，其纯度为89.38％，见图2。

图2TGF β纯化物SDS-PAGE凝胶电泳结果

左:标准蛋白;中：TGF β纯化物；右：TGF β标准品

Fig 2SDS-PAGE of purified TGF β

Left: Protein markers; Middle: purified TGF β;

Right: TGF β marker

2.4ELISE定量结果

从200 ml×30袋全血中可纯化325 μg的TGF β。

2.5纯化后TGF β生物活性鉴定结果见表1

表1纯化后的TGF β生物活性

Tab 1Biological activity of purified plate