第二军医大学学报1999年第20卷第8期

邓小华周芸曾瑞云蒋春雷路长林

摘要目的：制备睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)单克隆抗体。方法：将CNTF免疫的BALB/c小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，经3次克隆化培养，获得分泌CNTF单克隆抗体的杂交瘤细胞株；然后进行体内诱生获取含大量CNTF单克隆抗体的腹水和血清；再进行CNTF单克隆抗体鉴定和效价测定。结果：获得5株分泌CNTF单克隆抗体的杂交瘤细胞株，抗体亚型为IgG_2a；腹水和血清中该抗体效价分别为1∶10⁷～1∶10⁸和1∶10⁶；该抗体能特异性地显示SD大鼠脑内表达CNTF的神经元，其中1株单克隆抗体能抑制CNTF促进体外培养新生SD大鼠骨骼肌细胞增殖的功能。结论：制备成功高效且特异的CNTF单克隆抗体，为CNTF结构、功能和机制的研究提供了有效工具。

关键词：睫状神经营养因子抗体，单克隆

睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)是从鸡胚睫状神经节中提取出来的一种神经营养蛋白^［1］，在体内有广泛的生理功能，在病理条件下对机体的神经功能修复也具有重要作用，目前已展开CNTF临床应用的研究。但CNTF还存在许多未知领域，我们希望能通过制备CNTF单克隆抗体，为今后深入探讨CNTF的结构、功能和作用机制创造条件。

1材料和方法

1. 1 动物与细胞BALB/c小鼠（上海马普尔-必凯实验动物中心）；SP2/0骨髓瘤细胞（上海第二医科大学医学检验重点实验室）。

1.2主要试剂与器材完全及不完全福氏佐剂、RPMI 1640培养基、8-氮鸟嘌呤、 次黄嘌呤、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶（HAT,Sigma公司）；新生牛血清（杭州四季青生物试剂公司）；胎牛血清（Gibco公司）；聚乙二醇（Mr3700，Merck公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（效价1∶10⁴， Calbiochem公司）；邻苯二胺、底物缓冲液（上海第二医科大学医学检验重点实验室）；抗血清标准品IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM、IgA（DAKO公司）；细胞培养板（Nunc公司），酶联检测仪（BIO-RAD公司）。

1.3抗原制备CNTF系用重组DNA技术构建的人CNTF质粒，在大肠杆菌中表达，经离子交换交联葡聚糖层析和分子筛层析方法纯化后得到的重组蛋白，含200个氨基酸, 相对分子质量22 000，神经营养比活性为1.3 IU/ng，纯度大于95%^［2］ 。

1.4杂交瘤细胞株的建立、杂交瘤细胞染色体核型分析、体内诱生获取单克隆抗体、抗体效价测定和IgG类型及亚类鉴定采用文献［3］所述方法。

1.5CNTF单克隆抗体特异性鉴定取SD大鼠脑组织冰冻切片，用含CNTF单克隆抗体的杂交瘤细胞腹水进行免疫组化染色，设SP2/0骨髓瘤细胞腹水作阴性对照。

1.6对CNTF功能的影响体外培养新生SD大鼠骨骼肌细胞，传代至96孔细胞培养板(每孔3 000个细胞)，每行为1组，分空白组、对照组、CNTF组、CNTF-单克隆抗体B9(CNTF-B9)组、CNTF-单克隆抗体E7(CNTF-E7)组和CNTF-SP2/0组。24 h后，CNTF组给予CNTF 15 μg/ml，CNTF-B9组给予CNTF 15 μg/ml和10% B9鼠腹水，CNTF-E7组给予CNTF 15 μg/ml和10% E7鼠腹水，CNTF-SP2/0组给予CNTF 15 μg/ml和10% SP2/0鼠腹水，各组每孔培养液总量 200 μl，空白组和对照组添加等量培养液。72 h后结晶紫染色，酶联仪测定490 nm光密度值(D)。

1.7统计学处理数据以X±s表示，采用t检验。

2结果

2.1细胞融合率及抗体阳性率融合后细胞共制备了5块96孔细胞培养板，细胞融合率平均为62%。间接ELISA法检测克隆孔培养上清，抗体阳性率为40% ；有限稀释板第1次为15%，第2次为98%，第3次为100% 。

2.2杂交瘤细胞染色体核型经过细胞融合、筛选、克隆化和扩增培养后，获得G9、B9、F9、E7、E8 5株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。这5株细胞的染色体分析发现，分裂相中均有中部着丝点、亚中部着丝点等SP2/0骨髓瘤细胞染色体标记，亦有小鼠脾细胞端着丝点染色体标记，杂交瘤细胞染色体2n=84～110,平均94，符合小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的核型特点(图1)。

图1杂交瘤细胞核型

fig 1The chrosomes of hybrid cells

2.3抗体效价设SP2/0骨髓瘤细胞培养上清、腹水及血清作阴性对照，以D值≥阴性对照平均D值±2S者为阳性标准，出现阳性的最高稀释倍数为该腹水或血清的效价。杂交瘤细胞的培养上清抗体效价为1∶10⁴左右；腹水抗体效价为1∶10⁷～1∶10⁸；小鼠血清抗体效价为1∶10⁶。

2.4单克隆抗体Ig类型经琼脂免疫双相扩散法测定，杂交瘤细胞腹水中的抗体均为IgG_2a类。

2.5单克隆抗体的特异性杂交瘤细胞腹水能清晰地显示SD大鼠脑内分泌CNTF的神经元，但对其它神经元无显色反应；而SP2/0骨髓瘤细胞腹水处理的脑组织切片无神经元着色(图2)。表明所制备的单克隆抗体具有CNTF特异性。

图2SD大鼠脑组织神经元(A：杂交瘤细胞

腹水染色；B：SP2/0骨髓瘤细胞腹水染色)

Fig 2Neurons in SD rat brain tissure

(A: stained by ascitic fluid of hibrid cells;

B: stained by ascitic fluid of SP2/0 cells)

2.6单抗对CNTF功能的影响如图3所示(D值越大，表示细胞数量越多)：CNTF组、CNTF-SP2/0组和CNTF-B9组，细胞数量均明显多于对照组和CNTF-E7组(P＜0.01)；CNTF-E7组细胞数量明显多于对照组(P＜0.01)。表明CNTF可以促进体外培养的新生SD大鼠骨骼肌细胞增殖，E7细胞株产生的CNTF单克隆抗体可抑制该功能，而B9细胞株产生的CNTF单克隆抗体和SP2/0骨髓瘤细胞腹水对CNTF功能无明显影响。

图 3CNTF单克隆抗体对CNTF促进体外培养新生

SD大鼠骨骼肌细胞增殖功能的影响

Fig 3Effect of CNTF monoclonal antibody on the

proliferation of neonal SD rats skeletal

muscle cells treated with CNTF

n=12, x±s; ^**P＜0.01 vs control group;

^△△ P＜0.01 vs CNTF-E7 group

3讨论

CNTF广泛分布于神经系统，具备多种生物学功能：促进前体神经元生长、分化和成熟，维持各种神经元存活，促进损伤神经元再生修复，阻止神经元退行性变化，保护神经胶质细胞等^［4～6］。但是CNTF尚有许多未知领域：其基因调控元件还不十分清楚，释放机制还是一个谜， 高级结构尚无试验研究，具体信号传导过程尚不清楚，CNTF合成与代谢、生理功能及在病理状态下的作用等都还未完全认识。应用CNTF 单克隆抗体，可以更精确地分析CNTF及其受体的结构和分布，研究它们的基因表达、调控与信号传导，更可靠地检测它们的含量，动态观察CNTF的体内代谢和执行生物功能的情况等，为深入了解CNTF的结构、功能和代谢提供了一个极为有用的工具。

本实验所制备的单克隆抗体，能清晰地显示SD大鼠脑内分泌CNTF的神经元，而对其他神经元无显色反应，表明其具有良好的特异性，为有针对性地进行CNTF的研究提供了有利条件。 不同细胞株产生的单克隆抗体，对CNTF促进体外培养新生SD大鼠骨骼肌细胞增殖功能的影响不同，其中一株可明显抑制该功能，而另一株对该功能无影响，表明不同细胞株产生的抗体是来自不同的抗原决定簇的，使我们可以从不同角度研究CNTF，更增加了其可用性。

作者简介：邓小华，女，1970年5月生，硕士

作者单位：第二军医大学基础医学部神经生物学教研室，上海，200433；上海第二医科大学医学检验重点实验室，上海，200025

参考文献

1Alder R,Landa KB,Manthrope M,et al. Cholinergic neurontrophic factors: intraocular distribution of soluble trophic activity for ciliary neurons［J］. Science,1979, 204(4397): 1434

2何成，陈江野，路长林,等. 人睫状神经营养因子基因及突变体在大肠杆菌中