中华耳鼻咽喉科杂志1999年第34卷第３期

蔡晓岚王天铎史丽

摘要目的：研究多药耐药基因（multidrug resistance gene,MDR-1 mRNA）及其产物P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）、多药耐药相关蛋白基因（multidrug resistant-associated protein gene, MRP mRNA）的表达与喉咽癌患者临床病理特征之间的关系。方法：应用逆转录-多聚酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）技术，检测了25例晚期喉咽癌患者MDR-1 mRNA、MRP mRNA基因的表达；采用免疫组化SABC法对60例患者喉咽癌标本MDR-1基因产物P-gp进行检测。结果：初治喉咽癌组织中MDR-1 mRNA及P-gp的阳性表达率分别为48%（12/25）和38.3%（23/60），在RT-PCR检测的25例患者中，2项指标具有一致性（P＜0.05）；晚期喉咽癌MRP mRNA阳性表达率为52%（13/25），其阳性表达与肿瘤颈淋巴结转移(18/25)有明显相关性（P＜0.01）。结论：约48%的初治喉咽癌MDR-1 mRNA呈阳性表达，且与其基因产物P-gp有一致性关系。MRP mRNA在喉咽癌中的表达可能影响肿瘤播散、转移等生物学特性。

关键词：咽肿瘤抗药性多药基因表达聚合酶链反应

80年代以来，在头颈部晚期鳞癌的综合治疗中，化学治疗发挥日益重要的作用，喉咽癌的原发病变及转移淋巴结对化学治疗有较高的缓解率，改善了患者生存质量，但能否普遍提高生存率，尚存在争议^［1］,其中，多药耐药的产生是导致化学治疗失败的众多原因之一。本研究应用逆转录-多聚酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）技术，检测了25例晚期喉咽癌患者多药耐药基因(multidrug resistance gene,MDR-1 mRNA)、多药耐药相关蛋白基因(multidrug resistant-associated protein,MRP mRNA)的表达，同时采用免疫组化技术检测60例喉咽癌标本P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达，并探讨其临床意义。

材料及方法

一、研究对象

1.RT-PCR检测：我院1996年12月～1997年12月手术切除、经病理证实的喉咽部鳞状细胞癌25例，癌旁3 cm处正常喉咽粘膜2例。于癌肿切除后10 min内，无菌条件下切取癌组织，立即投入液氮或-86℃冰箱中冷冻保存。所有病例均为初治者，术前未经化学治疗、放射治疗或手术等治疗，男24例，女1例，年龄42～73岁，平均59.2岁。按1987年UICC头颈恶性肿瘤分期标准，T₃ 6例、T₄ 19例，N₀ 7例、N₁ 2例、N₂ 10例、N₃ 6例；原发于梨状窝16例、咽后壁7例、环后区2例；病理组织学分级：高分化9例、中分化6例、低分化8例、未分化2例。

2.免疫组化检测：我院1994年1月～1997年12月间临床资料完整的手术送检喉咽癌标本60例，癌旁正常喉咽粘膜标本2例。10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片。所有患者均为未经任何治疗的初治者，男54例，女6例；年龄42～74岁，平均60岁。按1987年UICC头颈肿瘤分期标准，T₁ 1例、T₂ 3例、T₃ 23例、T₄ 33例；N₀ 20例、N₁ 11例、N₂ 21例、N₃ 8例；其中原发于梨状窝44例、咽后壁9例、环后区7例。病理组织学分级：高分化18例、中分化22例、低分化17例、未分化3例。

二、 RT-PCR检测

1. 引物序列：为提高特异性，防止假阳性的出现，我们同时应用了两组PCR引物, 1组为MDR-1 或MRP 基因特异性引物,1组为β-肌动蛋白基因引物，扩增片段分别为MDR-1 425 bp、MRP 225 bp、β-肌动蛋白308 bp，经RT-PCR扩增并电泳后在308 bp处出现内对照扩增带，证实试验过程成功，可排除假阴性或假阳性。

MDR-1引物：

上游引物 5＇-AAA CCG ATC AAC TCG TAG TGG GA 3＇

下游引物 5＇-GCA AAT CAA ACA ACA CCA AA 3＇

MRP引物：

上游引物 5＇-TTC TCT GCT CTC CTC GAC GG 3＇

下游引物 5＇-GCC AGG AGC CTG CCT CTT TT 3＇

β-肌动蛋白引物，作为内对照：

上游引物 5＇-CAT TTG CTC CTC GTC GAA CA 3＇

下游引物 5＇-ATC ATG GTG TTT ACC TTC AACA 3＇

2.实验方法：①细胞总RNA提取：采用异硫氰酸胍一步法。②逆转录(RT)：取4 μl总RNA在65℃变性5 min，以清除RNA的二级结构。RT反应体系内含5×RT 缓冲液 1.5 μl、随机引物50 ng/次、dNTP 200 μmol/L、酶混合液1 μl（逆转录酶AMV及Rnasin 80 U/μl）,补水至15 μl。42℃保温反应30 min，以RNA为模板，在随机引物引导下及逆转录酶的催化下，合成与RNA互补的cDNA。③PCR扩增：以cDNA为模板，在特异性引物引导及Taq DNA聚合酶催化下，对特定的目的靶序列进行扩增。PCR反应体系内含10×PCR 缓冲液2.0 μl、特异性引物100 ng/次、dNTP 200 μmol/L 、Taq DNA聚合酶1 μl,补水至20 μl，加入逆转录产物10 μl、石蜡油20 μl，离心混匀，置于PCR仪上扩增30个循环，变性、退火、延伸所需温度、时间分别为94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s。④取10 μl PCR扩增产物反应液在2%琼脂糖凝胶上电泳，75 V 90 min，记录结果(图1)。

M: 分子量标准;+:表达阳性;-:表达阴性

图1喉咽癌患者MDR-1、β-actin（肌动蛋白)、MRP的RT-PCR产物电泳结果

三、免疫组织化学P糖蛋白（P-gp）检测

第一抗体鼠抗P-gp（单克隆抗体JSB1，Boehringer Mannheim生物化学公司，德国）。即用型SABC试剂（武汉博士德生物工程有限公司）。

实验步骤：蒸馏水新鲜配置3%H₂O₂，室温孵育；微波修复抗原；加复合消化液；加正常血清封闭液；加1∶50稀释的一抗50 μl，于4℃过夜；加生物素化山羊抗小鼠/兔IgG 50 μl，30℃孵育20 min；加SABC溶液，30℃孵育20 min；DAB显色，镜下控制反应时间。阳性结果判断：以肿瘤细胞胞浆内、核膜上出现棕黄色颗粒染色为阳性；根据整张切片肿瘤组织着色范围及强度，以阳性反应肿瘤细胞数≥10%为阳性。已知阳性的卵巢癌切片作阳性对照；PBS代替一抗作空白对照。

统计学处理为Fisher精确概率法直接计算P值。

结果

一、喉咽癌患者MDR-1 mRNA和MRP mRNA的表达

25例喉咽癌患者均经手术切除喉咽部原发肿瘤及颈部转移淋巴结，术后放射治疗55～70 Gy。其MDR-1 mRNA、MRP mRNA阳性表达率分别为48%（12/25）和52%（13/25），与患者性别、年龄、肿瘤原发部位、临床分期、病理组织学分级无关；随转移淋巴结分期的增高，MDR-1 mRNA表达有增高趋势，但差异无显著性 (P＞0.05)；MRP mRNA与颈淋巴结转移（18/25）有一定相关性(P＜0.01)。2例癌旁正常喉咽粘膜MDR-1 mRNA及MRP mRNA均呈阴性表达。随访12～24个月（平均15个月），复发12例，男11例，女1例，局部复发4例，颈部淋巴结转移6例，复发并远处转移后死亡2例。1～6个月内复发者4例，死亡1例 ；7～12个月复发4例，死亡1例；12～15个月复发2例。其中MDR-1阳性表达5例、MRP阳性表达者6例，均与肿瘤复发无相关性。

二、喉咽癌患者MDR-1和P-gp的表达

60例喉咽癌组织中，P-gp阳性染色23例，阳性率为38.3%（23/60），与患者性别、年龄、肿瘤原发部位、颈淋巴结转移、病理组织学分级无关。在原发肿瘤（23/60）与颈淋巴结转移灶（19/40）中，P-gp表达具有一致性(P＜0.05)。25例RT-PCR检测标本中，MDR-1 mRNA阳性表达12例，P-gp阳性染色10例，二项指标间具有一致性(P＜0.05)。P-gp定位于肿瘤细胞胞浆内或核膜上，以胞浆内染色更明显，呈棕黄色、细颗粒状（图2）。阳性细胞在肿瘤组织中呈灶状或弥散性分布，肿瘤间质及2例癌旁正常喉咽粘膜均未见阳性染色。在已知阳性的卵巢癌中，阳性细胞呈棕褐色、团块状分布。随访12个月～4年6个月（平均3年）,局部复发及远处转移者37例，男31例，女6例， 其中1～6个月15例，7～12个月12例，13～36个月8例，术后3～4年6个月2例。其中P-gp阳性染色14例，与肿瘤复发、转移无关。

图2喉咽癌患者P-糖蛋白(P-glycoprotein)免疫组织化学染色

讨论

多药耐药性是指肿瘤细胞对多种结构不同、功能不同、杀伤机制迥异的化学治疗药物同时产生交叉耐药的现象，它是恶性肿瘤化学治疗失败的主要原因。头颈部鳞状细胞癌常用的化学治疗药物有铂类化合物、烷化剂、抗代谢药物和有丝分裂抑制剂等。目前研究证实：P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白均为能量依赖性药物排出性膜泵^［2］，广泛分布于人体组织中，具有正常生理功能，且耐药谱相近，可将进入细胞内的脂溶性、天然性抗癌药物逆浓度梯度泵出细胞外，从而降低肿瘤<