国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第20卷第2期

中山医科大学附一院检验科(510080)

黄彬陈茶^{* （}综述）尹一兵^*俞纯山（审校）

摘要本文综述了肺炎链球菌蛋白质类毒力因子的生物学性质和参与致病的可能机制。近年来肺炎链球菌与致病有关的蛋白质越来越到重视。通过研究这些蛋白质类的毒力因子可以进一步弄清肺炎链球菌的致病机理，并从中筛选疫苗候选者，发展新一代多价疫苗，预防肺炎链球菌感染性疾病的发生，以克服目前荚膜多糖疫苗存在的两个主要缺点。

关键词：肺炎链球菌 蛋白质 毒力因子

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是一种重要的病原微生物，它可以引起机体局部和全身的感染，如肺炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症等^[1,2]。在全世界S.pn有较高的发病率和死亡率，尤其在老年人和2个月～2岁的婴幼儿中^[1]而目前对S.pn的致病机理并不十分清楚。

传统认为S.pn的毒力因子(virulence factors)主要是荚膜，它在带负电荷的S.pn荚膜多糖和吞噬细胞间产生静电排斥，并能阻止补体介导的调理作用^[2]。而最近越来越多的研究表明，S.pn的毒力因子并不仅仅是抗吞噬作用的荚膜。S.pn的一些蛋白质作为炎症介质或直接攻击宿主组织而在致病过程起重要作用，如溶血素、自溶酶、肺炎链球菌表面蛋白A、肺炎链球菌表面粘附素A、神经氨酸酶等^[1～5]。而且，近年来分子生物学的发展为研究这些蛋白质在致病过程中所起的作用提供了条件。因此，最近科学家们的注意力集中于S.pn蛋白质在致病过程中所起的作用，并致力于开发研究含蛋白质成分更高的新一代多价疫苗。现将这些蛋白质按性质归为三类，并将其生物学性质和作用机理综述如下。

1毒素类-溶血素

溶血素(pneumolysin)是S.pn产生的破坏细胞膜的巯基激活毒素^[4]。位于细胞内，经自溶释放出来，有多种生物学活性，能溶解真核细胞，妨碍细胞和免疫系统可溶分子的功能，对宿主造成损害^[2,4]。溶血素对不同类型的细胞有不同的毒性效应。高浓度的溶血素在哺乳动物细胞膜形成溶血素Oligomers，导致跨膜孔形成，引起细胞溶解^[4]。低浓度的溶血素有几个效应，这些效应在体外都被证实。该毒素能刺激人单核细胞产生炎症细胞因子，如TNF-α、IL-β，抑制人呼吸道上皮细胞纤毛摆动，破坏来源于上呼吸道和肺泡的单层上皮细胞，降低中性粒细胞的杀菌活性和适移性，抑制淋巴细胞增殖和抗体合成^[1,2,4]。并且，在抗毒素抗体缺乏的情况下溶血素能激活经典的补体途径，这个活性是通过结合抗体的Fc片段介导的^[1]。有趣的是，溶血素与C-反应蛋白(CRP)有一些序列同源^[2]。CRP是急性时相反应蛋白，能部分保护小鼠免受S.pn的攻击。与S.pn细胞壁多糖的磷酸胆碱残基结合后，CRP通过与C_1q因此溶血素可以通过激活补体来增强炎症过程，破坏呼吸道上皮，促使S.pn入血，刺激细胞因子产生。并且，溶血素可以通过与CRP竞争性结合C_1q来增强S.pn的致病力，从而抵消CRP的保护作用^[4]。不产生溶血素的S.pn变异菌毒力低于母菌，用溶血素免疫小鼠后可延长小鼠被不同血清型的S.pn攻击后的存活时间，因此溶血素被认为是一个重要的毒力因子^[1,2,4]。

2表面蛋白质

2.1肺炎链球菌表面蛋白A肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A，PspA)存在于所有的S.pn细胞壁表面，可能是一个跨膜蛋白，有很强的免疫原性，目前至少有31种不同的血清型，不同血清型的PspA分子量不同^[1,2,6,7]。SⅡ的PspA分子量为84kD，SⅢ的PspA分子量为92kD^[6]。PspA的单克隆抗体能保护小鼠免疫致死剂量S.pn的攻击，而PspA增强S.pn致病力的机理目前并不清楚，认为它可能是通过抑制补体活性来完成的^[2]。对PspA的结构分析认为，PspA单克隆抗体的识别位点在氨基端，该区具有高度可变性^[6]。PspA的这些特征类似于A群链球菌的表面蛋白—M蛋白。M蛋白被认为是参与细胞粘附作用的表面蛋白，它介导脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)与宿主细胞受体连接^[6]。用PspA的氨基端部分(43KD蛋白质)制得的疫苗具有良好的抗S.pn感染的作用^[7]。

2.2肺炎链球菌表面粘附素A肺炎链球菌表面粘附素A(pneumococcal surface adhesin a，PsaA)是1990年由Russell等人首次通过单克隆抗体发现的^[8]，存在于S.pn细胞壁表面，是37kD的脂蛋白，所有的S.pn都产生，是S.pn特异的，现已在E.coli中克隆成功^[8,9]。PspA免疫小鼠后对小鼠有保护作用，但其机制尚不清楚^[8]。因为它与血链球菌的粘附素SsaB、副血链球菌的粘附素FimA的DNA序列有高度的同源性，同源性分别为80％、92.3％，它们代表了链球菌的一簇细胞表面粘附素，直接或间接地影响了链球菌粘附于相应的宿主细胞及基质，因而有人认为PspA可能是参与粘附于呼吸道表面的S.pn的粘附素^[9]。1996年Berry等人用基因重组技术构建来源于Ⅱ型S.pn d39 PspA不表达的菌株PspA1^-和PspA2^-，通过功能实验发现这两株菌与亲代菌相比毒力降低，PspA1^-对A549细胞的粘附率仅为D39的9％，通过back-transformation重建PspA1^-的PspA的基因后，该菌株毒力恢复，从而首次证实PspA就是S.pn的粘附素^[10]。

3酶类

3.1自溶酶S.pn的自溶酶(autolysin)是36kD的N-乙酰胞壁酸-L丙氨酸酰胺酶，位于S.pn细胞壁，与LTA的胆碱分子相连^[1]。LTA与S.pn细胞壁上糖脂相连时自溶酶无活性，原因可能是自溶酶没有接近它的底物，因此LTA是体内调节自溶酶活性的重要物质。当S.pn细胞壁合成停止或营养物质缺乏或用抗生素如青霉素治疗时，LTA与自溶酶间的关系被破坏，此时自溶酶就水解聚糖链和细胞壁含胆碱的肽链间的共价结合，导致细胞自溶。去垢剂如脱氧的胆酸钠可释放和激活自溶酶^[1]。自溶酶导致S.pn自溶后，产生细胞壁降解产物，导致炎症反应，并促使溶血素从细胞桨中释放出来，对宿主造成损害^[2]。且最近的资料认为S.pn自溶酶表达水平的高低与S.pn菌落的形态有关，而菌落形态的阶段性变异(浑浊型、半透明型、透时型)与S.pn的致病过程有关^[11,12]。透明型S.pn细胞表面自溶酶LytA的表达水平高，能稳定地粘附定植于鼻咽部，而浑浊S.pn细胞表面LytA的表达水平低，不能定殖于鼻咽部^[12,13]，且只有透明型S.pn能粘附于炎症激活的宿主细胞^[14]。

3.2神经氨酸酶大量的研究表明S.pn产生的神经氨酸酶(neuraminidase)在致病过程中发挥了作用。所有的S.pn都产生了神经氨酸酶，它能增强S.pn对宿主细胞的粘附^[1,4]。神经氨酸酶通过破坏宿主细胞表面或体液中糖脂、糖蛋白末端的唾液酸残基，使宿主受到损害，并暴露出S.pn粘附素的受体，从而增强S.pn对宿主细胞的粘附^[2,3]。象溶血素一样，纯化的神经氨酸酶对小鼠有毒，可导致小鼠产生类似脑膜炎的症状^[1,4]。用该酶免疫小鼠后，可以部分保护小鼠免受致病性S.pn的攻击^[2]。神经氨酸酶有多种形式，目前S.pn产生的神经氨酸酶的数量是争论的焦点，有学者认为神经氨酸酶有几个同工酶，而另一些人则认为只存在一种神经氨酸酶，它被蛋白水解酶降产生多种形式^[4]。目前已在E.coli中克隆成功两个神氨酸酶基因，这两个基因不同，并且在不同血清型的S.pn中发现了这两个不同的基因^[1]。这两个基因的产物在结构和底物特异性上的关系并不清楚，而对这一点的理解对于阐明神经氨酸酶在肺炎链球菌性疾病中的作用是很重要的^[4]。表达后的神经氨酸酶可通过羧基端的疏水区Leu-Pro-X-Thr-Gly-X(可能是翻译后修饰的识别位点)连接于菌体胞膜外^[1]。

3.3肽类透性酶目前发现S.pn产生的肽类透性酶(peptide permease)有3个功能，(1)结合和运输小分子肽穿过细菌细胞膜，利于细菌代谢利用^[15]；(2)与粘附于宿主细胞有关^[15,16]。1995年Cundell等人通过构建S.pn输出蛋白缺陷的变异菌，然后研究这些菌对宿主细胞的粘附力，发现编码肽类透性酶的ami、plpA基因变异后，变异菌就不能识别宿主细胞表面的糖结合物受体GalNAcβ1-4Gal和GalNAcβ1-3Gal，从而变异菌对宿主细胞的粘附降低50％～60％，提示肽类透性酶与S.pn粘附于宿主细胞有关，但不清楚肽类透性酶是直接作为粘附素还是通过调节S.pn粘附素的表达而发挥作用^[15]。Cundell等人的实验还表明plpA位点的变异降低S.pn自然转化能力，而ami位点的变异增强S.pn的自然转化能力。这个结果提示有60％序列同源的PlpA和AmiA通过结合和运输信号分子，直接作为S.pn自然转化的调节成分^[16,17]。

3.4IgA1蛋白酶S.pn能分泌IgA1蛋白酶(IgA1 protease)，该酶识别抗体转折区域内的一个特定位点(227和228位的脯氨酸-苏氨酸键)^[18]，将IgA1分解为完整的Fab和Fc片段保留了它们的抗原特异性，这个片段结合到细菌表面可以使细菌不再结合完整的免疫球蛋白，从而保护不被免疫系统清除。而且，任何基于Fc片段的IgA-免疫复合物清除机制都会被破坏。因此S.pn产生的IgA1蛋白酶能妨碍粘表面宿主