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1999年 PROGRESS OF ANATOMIAL SCIENCES 1999
冯继明 吴江声
（北京医科大学组织胚胎学系 北京 100083）
CD4-CD8-前体细胞（Precursor thymoytes,Pre-T）进入胸腺后，随即开始γ、δ和βTCR基因的重排，其中一个结局是发展成CD4-CD8-γδ+T细胞，而另一个结局是发育成CD4+CD8+双阳性（double positive,DP）胸腺细胞。后者中的50%表达低水平的αβTCR，CD4+CD8+平均寿命大约有3天，每天以5×107个细胞的速率更新。只有很少量的细胞（约1×106个细胞/天）能够发育成CD4+CD8-或CD4-CD8+成熟的单阳性（single positive,SP）细胞，离开胸腺，如图所示（引自Boehmer H:Immunl Today1989,10(2):57）
从以上数据可以看出绝大多数的CD4+CD8+双阳性细胞在没有发育成熟之前就已经死亡了，即大约每天有95-98%的细胞死亡，而能够发育成熟的细胞只有2-5%[1]。
胸腺细胞发育简图。CD4 8细胞开始δ、γ和β基因重排（右上角），一条途径分化为CD48，γ+γ+后代，另一条途径分为CD4+ 8+胸腺细胞，后者中50%的细胞表达αβ异二聚体，这些细胞通过抗原受体的特异性被选择分化为CD4+8或CD4 8+成熟T细胞，然后迁出胸腺。
DP细胞死亡的形式是细胞凋亡（apoptosis）,又称细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）。造成DP细胞死亡的原因有二：其一是DP细胞受到阴性选择，加速了其死亡进程；其二是阳性选择失败导致的死亡，即DP细胞没有被阳性选择选中而有机会继续发育，这种死亡的过程是相对缓慢进行的[2]。
DP细胞的死亡地点目前争议最大，归纳起来是两种观点：
1.胸腺内死亡假说（intrathymic death hypothesis）：
以Scollay R.G为代表，认为DP细胞是在胸腺内死亡，他的实验根据是，用FITC于胸腺内注射可以随机标记胸腺细胞，之后不同时间检查各种外周器官中FITC标记细胞的数量，这样可以计算出每天有多少细胞从胸腺中输出。他得到的结果是：幼年的小鼠每天约有1%的胸腺细胞离开胸腺，而大多数胸腺细胞95%在胸腺中死亡了。输出胸腺的细胞主要定居于淋巴结、脾和Peyer's patches和T细胞依赖区，而在骨髓、肠和肝中却是非常的少[3]。
当时此学说有一个最大遗憾就是在正常胸腺的组织学切片上很少看到死亡的胸腺细胞，这样就很难与胸腺细胞在胸腺内原位死亡的观点相吻合。虽然如此，这一观点仍然被大多数学者所认同，成为流行观点。
2.胸腺外死亡假说（extrathymic death hypothesis）：
这个学说曾经给胸腺细胞成熟的理论一个很大的震动，由Quackenbush和Shields提出，他们的文章1989年发表于Cell tissue Kinet 21:381上，他的实验数据说明胸腺细胞不必一定要在胸腺内死亡。他的实验所依据的原理是：核甘酸清除酶（nucleotide scavenging enzyme）利用thymidine的效率要比利用iododeoxyuridine的效率高，可以将thymidine和iododeoxyuridin用放射性同位素标记，分别进行胸腺内注射。如果标记上其中的任意一种核苷的细胞是在胸腺内死亡的话，那么一部分释放的核苷会被新的分裂细胞重新利用，从而减慢胸腺内放射活性的损失，因而可以预测在胸腺内标记thymidine的损失曲线要比iododeoxyuridine的损失曲线要平缓，即thymidine的损失要比iododeoxyuridine的损失慢。这种差异说明胸腺细胞是在胸腺原位死亡。而如果标记细胞的死亡是在胸腺以外的其他地点，那么thmidine和 iododeoxyuridine在胸腺内消失的速率应该相等。
Quackenbush的结果是：如果用125I标记thymidine和 iododeoxyuridine，那么 iododeoxyuridine的损失要比thmidine快，说明支持胸腺细胞在原位死亡；但是如果换用3H作为标记，则发现两者的消失速率相等，这又说明胸腺细胞的死亡是发生于胸腺之外。作者分析了以上矛盾后认为125I标记的 iododeoxyuridine其上的标记物容易分解（deiodination）下来，所以造成差异，而3H标记更稳定且客观。最后Quackenbush认为胸腺细胞在死亡溶解之前就已经离开了胸腺[4]。
这个学说也有一些问题不能解决，它最大的障碍是没能够指明一个DP细胞的死亡地点，即：既然胸腺不是DP细胞的死亡坟墓，那么DP细胞死在哪里呢？在外周淋巴器官中新迁移来的细胞中缺少DP细胞。但是这可以被解释为：①DP细胞进入胸腺外周淋巴器官后存活时间极短；②行将死亡的DP细胞“归巢”（homing）能力差，找不到淋巴结或脾来停留；③DP细胞表面缺乏唾液酸，也就是表面缺乏应有的负电荷，因此他们流经肝脏时可被肝脏中的无唾液酸糖蛋白受体所识别结合，在此被消灭，并且也有实验说明DP细胞在小肠中被破坏[5]。总之，无论DP细胞是死在脾还是死在以上其他器官，它的性质可能都有些象短寿命的血细胞一样，如中性粒细胞，在外周血中只能存活1-3天。
随后几年的研究又给此学说增添了证据。Hirakawa等人1989年，利用一系列胸腺移植及骨髓重建实验，经免疫组织化学及流式细胞术，证明胸腺髓质区的血管是没有屏障的，外周T细胞可以自由出入[9]。从解剖学的角度上，说明胸腺细胞也是可以迁出胸腺外死亡的。Bonomo等人指出，在出生3-4天的新生小鼠的淋巴结中，确实存在一定数量的CD4+CD8+双阳性细胞，这些细胞的表面的CD3分子及HSA（heat stable antigen，热稳定抗原）的表达与胸腺内DP细胞表型一致[6]。胸腺外死亡假说从理论上有了根据，但是遗憾的是这些实验均非直接从细胞凋亡的角度探讨问题。
然而就在这时，1994年Surh C.D 和Sprent J的研究支持了第一个假说即胸腺内死亡说，他们用新的技术TUNEL方法在胸腺原位检查死亡细胞的情况，所依据原理是：发生凋亡的细胞在细胞膜没有破裂的早期，其DNA已经发生了断裂，结果是比正常细胞暴露出更多的3'-OH末端，利用末端转移酶（TdT termianl transferase）和地高辛标记的dUTP(dig-dUTP)等孵育不同条件下的胸腺切片，行将死亡的细胞比正常的细胞标记上更多的dig-dUTP，在免疫组织化学的显色时颜色更深。这个方法的好处是灵敏度高，能够在形态学上还没有发生变化之前就能显示出死亡细胞。他们的结果发现在成年正常小鼠的胸腺中，凋亡的细胞成族分散于整个皮质中，并且被当地的F4/80+巨噬细胞所吞噬[7]。同年，Aguilar等人又提出了胸腺保姆细胞（thymic nurse cell,一种特殊的上皮细胞）有清除凋亡胸腺细胞的作用，他用anti-CD3诱导小鼠胸腺细胞凋亡，用分离保姆细胞的特定方法从此时胸腺中得到的保姆细胞比正常情况下多了8倍，而每个保姆细胞中胸腺细胞均有95%以上发生调亡，这就是说除了巨噬细胞以外，胸腺上皮细胞也参与了对死亡胸腺细胞的清除[8]。我们的实验也说明，胸腺上皮细胞能吞噬死亡的胸腺细胞，但效率不高[9]。
分析以上两种观点，各有其证据，Scollay的胸腺内死亡学说目前证据较为丰富，易于为大家接受，原因之一就是他指明了胸腺细胞的死亡地点，人们可以沿着他所指的方向去找证据。而Quackenbush的胸腺外死亡学说，至今仍无其他证据，原因之一他只是证明了胸腺细胞不在胸腺内死亡，而没有指出一个明确有胸腺细胞死亡地点，所以很难验证。
我们最近的实验在形态学上首次为胸腺外死亡假说找到了直接证据，说明胸腺细胞不必一定在胸腺原位死亡，它也可以获得死亡信号之后进入血管，随血液循环至外周最终死亡。实验采用的胸腺外植块培养法实验既能够模拟胸腺微环境中胸腺细胞的发育周期又能够切断血液流通，理论上造成一种胸腺封闭状态（产生的胸腺细胞不能迁出胸腺外，假如某些胸腺细胞有迁出倾向，它也只能堆积于胸腺血管内）。培养3天后，在透射电子显微镜下观察到胸腺外植块血管内存在有胸腺细胞，并且处于不同的凋零时期。所以我们的观点是：胸腺细胞同时存在胸腺内死亡和胸腺外死亡的两种方式，一部分胸腺细胞是在胸腺原位死亡的，而另一部位胸腺细胞是迁出胸腺后死亡溶解的[10]。
参考文献
