摘要目的和方法：探讨中国湖北汉族重症肌无力(MG) 患者与HLA-Ⅱ类等位基因的关联。利用PCR/SSP和PCR-RFLP技术对湖北地区91例MG患者进行 HLA-Ⅱ类(HLA-DRB1、DQB1和DPB1)基因型别分析，并与168例正常个体比较。结果：患者组(1)：HLA-DRB1*0901、DQB1*0303和DPB1*0501等位基因频 率明显高于对照组，RR值分别为4.12、3.04和3.01，P＜0.01；(2)HLA-DPB1*0202 等位基因频率明显低于对照组，RR值为0.13，P＜0.05。结论：中国 湖北汉族群体中MG与HLA-DRB1*0202、等位基因正关联，而与HLA-DPB1*0202等位基因呈 负关联，与白种人群相比，这种关联对中国湖北汉族MG病人来说是特有的。

Association of HLA class Ⅱ (DRB1/DQB1/DPB1) alleles and myasthenia

gravies in the Han nationality of Hubei province

GONG Fei-Li, YANG Zhi-Zhang, XIONG Ping, XU Jing-Zhi,

XU Yong, JIANG Xiao-Dan, WU Xiong-Wen

Department of Immunology, Tongji Medical University, Wuhan(430030)

S.Ferencik, Yanjun Liu, H. Grosse-Wilde

Institute of Immunology, Essen University, Germany

Abstract：AIM：To investigate the association of polymorphism o f HLA class Ⅱ genes (DRB1/DQB1/DPB1) with myasthenia gravies(MG).METHODS：HLA class Ⅱ alleles of 91 patients with MG and that of 168 normal individuals of Han nationality of Hubei province were typed by using PC R/SSP and PCR/RFLP.RESULTS：(1) Gene frequencies of HLA-DRB1*090 1(RR=4.12, P＜0.01), HLA-DQB10303(RR=3.04,P＜0.01) and DPB1*0501(RR =1.22,P＜0.01) are much higher in MG patients than in normal controls; (2) Gene frequencies of HLA-DPB1*0202(RR=0.12,P＜0.05) are much lower in MG pa tients than in normal controls.CONCLUSION：There is a positive co rrelation between HLA-DRB1*0901、DQB1*0303、DPB1*0501 and MG. There is a nega tive correlation between HLA-DPB1*0202 and MG. These correlations are peculiar to MG patients of the Han nationality of Hubei province, as compared with Caucas ians.

MeSH：Myasthenia gravis; HLA antigens; Gene expression

重症肌无力(myasthenia gravis, MG)属于一种自身免疫病，患者体内 产生高水平抗乙酰胆碱受体(AchR)抗体，后者与骨骼肌运动终板上AchR结合，导致骨骼肌功 能障碍。本文借助多聚酶链式反应/序列特异性引物(polymerase chain reaction/ s equence specific primers, PCR/SSP)及PCR/RFLP技术对中国湖北汉族MG患者和正常人群进 行HLA-DRB1 、DQB1和DPB1基因多态性的群体分析，研究中国湖北汉族MG与HLA-Ⅱ类基因的相关性，以期 进一步探讨MG免疫学异常的机制，并为寻找MG的疾病易感基因提供线索。

材料与方法

(一)病例：MG患者91名，均为同济医科大学附属同济医院神经内科门诊病人；正常对照组16 8名，均为湖北省武汉市郊区献血员；二组年龄及性别分布相似，且均为湖北籍随机抽样个 体。

(二)主要试剂：蛋白酶K、Taq聚合酶、琼脂糖(Boehringer Mannheim)，HLA-DRB1与HLA-DQB 1等位基因序列特异性引物(德国ESSEN大学Grosse-Wilde教授惠赠)，dNTP(Pharmacia)。

(三)模板制备：按改进的盐析法从外周血淋巴细胞提取基因组DNA，用紫外分光光度计(Shim adzu Ur-120-02)测定DNA含量及浓度，OD_260nm/OD_280nm须在1.6～1.8。

(四)用于HLA-DRB1、HLA-DQB1多态性分析的PCR/SSP技术^［1］：

1.HLA-DRB1及HLA-DQB1等位基因特异性引物(SSP)：针对HLA-DRB1及DQB1第二外显子多态性 设 计SSP，其所扩增产物具有相应等位基因特异性，分型结果与血清学方法测得的HLA-DR及HLA -DQ表型具有对应关系。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，从而可 通过PCR反应特异性地扩增该基因片段。

2.PCR扩增体系的成分为：基因组DNA 50～100 ng、Taq酶0.5 U、dNTPs各200 μmol、SS P 2 pmol。PCR反应条件为：预变性94℃ 5 min，然后变性94℃ 30 s；退火65℃ 1 min；延 伸72℃ 1 min，共30个循环。

3.特异性扩增产物的检测：PCR产物经2%琼脂糖凝胶(含溴乙啶)电泳(条件为10～15 V/cm凝 胶，15 min)，经紫外透射在泳道中见明显DNA条带为阳性。

4.PCR反应假阴性和假阳性控制：每一个PCR反应中都含有一对扩增基因和一个保守基因(人 生长激素，350 bp)的引物，对这个保守基因的扩增有可能受到抑制，其作用是作为阳性质 控。

(五)HLA-DPB1的多态性分析采用PCR/RFLP技术：基因组DNA抽提后，DPB1基因第二外显子的P CR扩增，扩增产物的酶切消化，消化片段的电泳分离和显示等见参考文献^［2］。DP B1基因第二外显子扩增引物核苷酸顺序如下：

PB101N： 5’-GTGAAGCTTTCCCCGCAGAGAATTAC-3’

PB201： 5’-GTCGCGGCTCCACTCACTGACGTCCAC-3’

用于消化扩增产物的限制性内切酶为Bsp1286Ⅰ、FokⅠ、DdeⅠ、BsaJⅠ、BssHⅡ、Ctr13Ⅰ 、RsaⅠ、EcoNⅠ、AvaⅡ

(六)统计处理：采用直接计数法计算等位基因频率。相对危险性(relative risk, RR)按Woo lf公式计算：RR=ad/bc。式中a为群体中携带某一特定HLA型别的患者数；d为不携带某一 特定HLA型别的正常对照人数；b为不携带某一HLA型别的患者人数；c为携带某一特定HLA型 别的正常人数。RR值显著性检验采用精确概率P值法，并经校正(Pc)。P值的 计算按下列公式：

Pc=P×等位基因个数

结果

一、MG与HLA-DRB1等位基因的关联：

MG患者携带HLA-DRB1*0901等位基因频率明显高于正常组，RR值为4.12，差异显著( P_c＜0.01)；DRB1*0301等位基因频率明显低于正常组，RR值为0.28，但经校正 后差异无显著(P_c＞0.05)，结果见表1。

二、MG与HLA-DQB1等位基因的关联：

MG患者组HLA-DQB1*0303等位基因频率明显高于正常组，RR值为3.04，差异显著(P_c ＜0.000 1)；DQB1*0604等位基因频率明显低于正常组，RR值为0.063，经校正后差 异无显著(P_c＞0.05)，结果见表2。

三、MG与HLA-DPB1等位基因的关联：

MG患者组HLA-DPB1*0501等位基因频率明显高于正常组，RR值为3.01，差异显著(P_c ＜0.01)；DPB1*0202等位基因频率明显低于正常组，RR值为0.13，差异显著(P_c＜0 .05) ，结果见表3。

讨论

重症肌无力是一种典型的神经系统自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全清楚。自70年代以 来，国内外均对MG与HLA表型的相关性进行了大量研究，其结果不完全一致^{［3～ 5］}。随着分子生物学技术的发展，自80年代后期起，国外开始在基因水平分析HLA多态 性，并有多个实验组报道了MG与HLA-Ⅱ类等位基因型别存在关联^［6～8］。国内迄 今尚无MG与HLA-Ⅱ类基因型别相关性的系统报告。

本文作者借助PCR/SSP和PCR/RFLP技术分析湖北汉族MG患者与正常对照组HLA-Ⅱ基因多态性 ，结果发现MG患者HLA-DRB10901、DQB10303和DPB1*0501等位基因频率明显升高，其RR 值分别为4.12、3.04和3.01，差异有显著性。另外，MG患者HLA-DPB1*0202等位基因频 率降低，且RR值为0.13，经检验差异有显著性。上述结果表明，中国湖北汉族MG与HLA-DRB 1*0901、DQB1*0303和DPB1*0501有正关联，与HLA-DPB1*0202有负关联。

HLA各等位基因频率的分布格局随种族及地域差异，具有不同特点。HLA-DRB1*0901等位基 因在白种人中是一种频率较低的等位基因，但我们的调查结果显示，中国湖北汉族正常人群 中HLA-DRB1*0901基因频率为14%，而MG患者中该基因频率高达30.8%，存在明显关联；尤 其还发现6例MG患者为HLA-DRB1*0901纯合子个体。DQB1*0303基因频率在中国湖北汉族正 常人群中为18.4%，MG患者中为33.5%，亦存在明显关联。

有关HLA与疾病关联的机制未完全弄清，根据早期的实验结果，一般认为关联现象的出现很 可能是由于特定的HLA等位基因与多基因疾病的易感基因之一处于连锁不平衡，故发生关联 的HLA等位基因仅是疾病易感基因的一种遗传标志。近年来，在对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)与HLA关联的研究中发现，不同人种中RA与不同HLA-DRB1等位基因关联，但 这些不同型别的HLA-DRB1等位基因产物在肽链的特定位置具有相同的氨基酸序列，称为共同 表位(shared epitope)^［9，10］。后者可能