摘要目的：（1）建立“凋亡的细胞间诱导”的球体细胞培养实验系统，（2）在该系统中研究BPV的致癌机制。方法：采用三维立体细胞培养技术，制作以转化细胞为核心，正常细胞为外壳的细胞球，模拟体内肿瘤细胞生长于正常细胞间的情形，观察癌基因src、化学致癌剂甲基胆蒽及BPV转化细胞在细胞球中凋亡产生情况。结果：在球体细胞培养实验系统中，在src转化细胞产生凋亡的条件下，甲基胆蒽转化细胞同样能产生凋亡，而BPV转化细胞则抵抗了由周围正常细胞所致的凋亡。结论：（1）“凋亡的细胞间诱导”在球体细胞培养实验系统中，即在近似体内的条件下，不需要外源性TGF-β的参与同样可以产生，球体细胞培养实验系统是理想的研究近似体内条件下“凋亡的细胞间诱导”的模型，（2）由于BPV转化细胞能抵抗“凋亡的细胞间诱导”，因此可以作为BPV致癌机制一种解释，即BPV不仅能诱导细胞转化，而且能保护已经转化的细胞不被“凋亡的细胞间诱导”所清除。

分类号R361.2文献标识码A

文章编号1001-7399(1999)05-0435-03

Study on BPV-transformed cells resistant to intercellular induction of apoptosis in spheroids

Deng Hong, Zhang Jianmin, Su Ning et al

(¹Dept of Pathol, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009)

(Dept of Pathol, Tongji Medical University, Wuhan430030)

G Bauer

(Invst of Virol, Freiburg University, Freiburg79104, Germany)

ABSTRACTPurpose（1）To establish spheroids culture system for intercellular induction of apoptosis. (2) To study the carcinogenesis of bovine papillomavirus (BPV) in this system.Methods By means of three-dimensional tissue culture techniques containing transformed cells surrounded by nontransformed cells, to imitate tumor cells growing among normal cells in vivo and observe the apoptosis of src-, chemical and BPV-transformed cells. Results In spheroids culture system, under the condition of apoptosis of src-transformed cells, the apoptosis of chemical transformed cells were also induced by normal cells, but BPV-transformed cells were resistant.Conclusions (1) Intercellular induction of apoptosis functions without the addition of exogenous TGF-β under “quasi in vivo”. (2) BPV-transformed cells were resistant to intercellular induction of apoptosis, and thus it defined one procarcinogen function of BPV, which not only induced the transformation of cells but also protected them from the elimination by the intercellular induction of apoptosis.

KEY WORDS intercellular induction of apoptosis; three-dimensional tissue culture (spheroids); transformed cells; bovine papillomavirus (BPV)

新近发现的“凋亡的细胞间诱导”被认为是控制肿瘤发生的又一种方式^〔1〕。这一概念由Bauer小组首先提出^〔1，2〕。他们的实验发现经TGF-β或FGF处理的未转化的纤维母细胞能释放某种信号分子——凋亡诱导因子（apoptosis inducing factors, AIF），AIF特异性地作用于转化细胞致其凋亡，从而清除可能形成肿瘤的细胞。“凋亡的细胞间诱导”是在普通细胞培养的条件下被发现的，需要有外源性TGF-β的参与。笔者试图借助球体细胞培养实验系统，不加入外源性TGF-β，研究在近似体内条件下，“凋亡的细胞间诱导”的产生，并从“凋亡的细胞间诱导”方面，揭示BPV的致瘤机制。

1材料和方法

1.1细胞系和细胞培养208F细胞是大鼠正常纤维母细胞，208Fsrc3细胞是由病毒src癌基因转化的大鼠纤维母细胞；C127细胞是未转化的小鼠纤维母细胞，该细胞最初是从乳腺癌组织中分离出的，C127BPV细胞是由牛乳头状瘤病毒I型转化的小鼠纤维母细胞；C127M5细胞是由化学致癌剂甲基胆蒽转化的小鼠纤维母细胞。上述细胞均由德国Bauer教授惠赠。

所有细胞在含有Eagle液的塑料培养瓶中培养。培养液含有5%灭活补体的小牛血清，抗菌素和谷氨酰胺。细胞每周传代1～2次。

1.2细胞球的制备细胞球分两部分形成：内核（转化细胞）和外壳（未转化细胞）。其过程如下：先将转化细胞悬液（4×10⁵ ml^-1）1 ml加入至1.5 ml的塑料离心管内，静置2 h后，以4.2 r·min^-1转速旋转培养6 h。将培养液去除，加入等量的未转化细胞，继续旋转培养至第4天。每天换液一次。

1.3形态学观察细胞球用3%多聚甲醛固定12 h，经15%的蔗糖脱水处理12 h后，OCT包埋，制作6 μm厚的冷冻切片。切片用于细胞凋亡的检测。

1.4细胞凋亡的检测

1.4.1荧光染色细胞球冷冻切片用PBS冲洗后，滴加1 μg·ml^-1荧光染液(Hoechst 33258)，室温避光孵育30 min。蒸馏水冲洗，McIIvane缓冲甘油封片。切片用荧光显微镜在395～440nm波长下观察。

1.4.2TUNEL染色操作按照TUNEL试剂盒说明进行，本实验试剂盒由德国Boehringer公司提供。

1.4.3双染色法即TUNEL染色后用荧光染色，即显示DNA链的断裂，又显示染色质的凝聚，从而更好地证实细胞的凋亡。

2结果

2.1球体细胞培养实验系统中细胞凋亡的观察将208Fsrc3转化细胞为核心、208F细胞为外壳制成的细胞球连续培养，发现第4天时，在二者的交界处存在大量的核碎片，该碎片经TUNEL染色呈阳性反应(图1)，因此荧光染色显示的核碎片数可以近似代表凋亡细胞数。为了证实交界处的凋亡细胞确来自208Fsrc3细胞，我们将转化细胞（208Fsrc3）和正常细胞（208F）分别用红色和蓝色荧光小球标记，在细胞球刚形成之时，可见2种细胞形成明显的交界线(图2)，将细胞球连续培养至第4天，在荧光显微镜下观察，可见凋亡细胞位于红色标记的转化细胞（208Fsrc3）侧。定量研究进一步明确交界处的凋亡细胞数明显高于核心中央部及外壳周边部细胞。

图1 交界处的荧光染色（左）所见的核碎片经TUNEL染色（右）呈阳性，提示为细胞凋亡。荧光与TUNEL双染色×400

图2 细胞球中正常细胞与转化细胞分界清楚转化细胞为红色，正常细胞为蓝色，二者之间有明确的界限。×400

2.2在细胞球内，化学致癌剂转化细胞凋亡的产生将C127M5转化细胞为核心、C127细胞为外壳制作同样的细胞球，连续培养，取第4天的细胞球经切片染色后观察，结果显示交界处的C127M5转化细胞侧的细胞凋亡数明显高于核心中央部及外壳周边部。

2.3在细胞球内，BPV转化细胞不产生凋亡将C127BPV转化细胞为核心、C127细胞为外壳制作同样的细胞球，连续培养，取第4天的细胞球经切片染色后观察，无论在交界处或是核心中央部及外壳周边部均未见明显的细胞凋亡存在。

3讨论

3.1球体细胞培养实验系统中细胞凋亡的建立最初关于“凋亡的细胞间诱导”的研究主要借助于普通的二维细胞培养技术，在这种条件下，需要加入外源性TGF-β才能观察到这种机制发挥的最大效应。为了观察该机制是否可能在体内发挥作用，就应当将该系统置于体内环境中。因此，我们采用三维立体细胞培养技术，成功地尝试了不同于常规的细胞球制备方法^〔3〕，将定量细胞放入一定体积的容器内旋转，形成大小适当的细胞球——在保证细胞球中心不存在缺氧的前提下，最大限度的在交界处出现细胞凋亡——从而建立起一种模拟体内环境的实验系统（球体细胞培养系统）。在实验中，转化细胞聚集成球，类似体内微小肿瘤形成，加入正常细胞后，即模拟肿瘤生长于正常组织之间的情形。由于转化细胞互相紧密相连，分泌大量TGF-β，刺激周围正常细胞产生并释放AIF，从而致转化细胞凋亡。本研究的发现强烈地提示这种“凋亡的细胞间诱导”机制能在体内象体外一样发挥作用，因此推测它很可能代表着一个人类目前尚未被认识且机体业已存在的去除转化细胞的控制机制^〔1〕。

3.2BPV的致癌机制之一：抵抗“凋亡的细胞间诱导”机制在球体细胞培养系统中，我们对三种不同的转化细胞进行了实验，由癌基因src转化的细胞制备的细胞球，在培养至第4天时，交界处的转化细胞出现明显的凋亡，同样地，由化学致癌剂甲基胆蒽转化的细胞制成的细胞球中交界处转化细胞也表现出细胞凋亡，虽然凋亡产生的程度弱些。这些实验结果证实体