中华病理学杂志2000年第29卷第1期

孙慧勤卞修武陈意生史景泉

摘要目的：观察去甲二氢愈创木酸（NDGA）对胶质瘤细胞诱导的内皮细胞迁移的影响。方法：采用微孔滤膜培养小室及双室细胞联合培养法，进行人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞与人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞的联合培养，并以免疫组化SP方法检测SHG-44细胞血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达。结果：100 μmol/L 的NDGA作用1～3 d后，SHG-44细胞VEGF、bFGF 的表达明显降低。100 μmol/L NDGA对内皮细胞的非定向运动有明显抑制作用，对胶质瘤细胞及其条件培养基诱导的内皮细胞定向迁移抑制显著（P＜0.01）。在50、100、150、200 μmol/L 的实验浓度范围内，其抑制作用呈明显量效关系（抑制率各为12.0%，37.4%，86.7%和82.2%）。结论：NDGA对内皮细胞的非定向运动和胶质瘤细胞诱导的迁移均有抑制作用，并可降低瘤细胞血管生成因子的表达，提示NDGA具有抗血管生成的作用。

关键词：去甲二氢愈创木酸神经胶质瘤内皮，血管共同培养

恶性胶质瘤是临床难以根治的原发性肿瘤之一，血管增生活跃不仅是该瘤的病理特征，也是该瘤发展的重要原因。近年来，肿瘤血管生成的理论研究和实践都得以迅速的深入和开展^［1，2］。我们在应用去甲二氢愈创木酸（nordihydroguaiaretic acid，NDGA）抗胶质瘤研究时，发现它能明显减少移植瘤及诱发瘤的血管生成。在肿瘤血管生成中，内皮细胞向肿瘤细胞移行是实现肿瘤血管生成的重要环节，阻止此步的发生即能有效控制肿瘤血管生成。因此，我们就NDGA对内皮细胞及胶质瘤细胞诱导的内皮细胞迁移的影响进行了研究。

材料与方法

一、细胞培养、胶质瘤条件培养基的制备

人脐静脉内皮细胞系ECV-304(引自美国组织培养库，ATCC CRI-1998)和人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞（引自苏州医学院附属第二医院脑肿瘤研究室）。分别在含10%新生小牛血清、双抗（青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml）的M199和RPMI 1640培养基（Gibco公司产品）中常规培养。

等量的SHG-44细胞分别在含NDGA液(终浓度为100 μmol/L)和等体积PBS（pH 7.2）的含0.5%新生小牛血清的M199液10 ml中培养24 h，取上清，离心，0.22 μm微孔滤膜过滤，分别标记为条件培养基1、2（CM1,CM2），-20℃保存备用。

二、NDGA对胶质瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白表达影响的观察

经NDGA(终浓度为100 μmol/L) 或 PBS（pH 7.2）处理后1～3 d的SHG-44 细胞，经4%多聚甲醛固定，采用SP法（Zymed公司产品）进行VEGF、bFGF（PcAb,1∶20, Santa Cruz 公司产品）的免疫组化染色。

三、迁移实验

1．微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统：双室联合培养结构见图1。应用微孔滤膜培养小室，进行胶质瘤细胞与内皮细胞的联合培养，可以更接近体内环境，模拟瘤细胞对血管内皮细胞的作用，滤膜上8 μm的微孔可允许内皮细胞穿过到达膜的下面，这些穿越迁移的内皮细胞可粘附于膜的下面，通过计数滤膜下面的细胞可基本反映细胞的迁移情况。

图1双室联合培养示意图

2．SHG-44细胞诱导的迁移实验：用已长满的SHG-44细胞消化后制成悬液，用含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养基调节其细胞浓度为1×10⁵个/ml。对不同胶质瘤细胞相关的试验：分别按每孔细胞数为0、1×10⁵个的量传入12孔培养板内，补加含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养基至2 ml/孔，置于孵箱内培养。5 h后待细胞贴壁，吸出培养基，以D-Hanks液洗2次，加入含0.5%新生小牛血清M199或含100 μmol/L NDGA及0.5%新生小牛血清 M199液，入孵箱内培养。对不同浓度NDGA相关的试验：按每孔细胞数为1×10⁵个的量传入12孔培养板内，培养5 h后吸出培养基，以D-Hanks液洗2次，加入含0.5%新生小牛血清 M199或各含50、100、150、200 μmol/L NDGA的0.5%新生小牛血清 M199液2 ml/孔，入孵箱内培养。每组3孔，并至少重复3次试验。18 h后取出，装配PET微孔滤膜培养小室（上室，Falcon Cell Culture Insert，Becton Dickinson公司产品）入12孔板（下室）内，同时消化生长良好的内皮细胞，调整其浓度为10⁵个/ml，每个小室内加入0.1 ml (1×10⁴个细胞)，轻轻振荡使之分布均匀，放入孵箱内进行胶质瘤-内皮细胞的联合培养。6 h后取上室，以棉签拭去小室滤膜上的内皮细胞。PBS洗后将小室置于95%乙醇中固定10 min，PBS洗5 min 2次，苏木素染色2～5min，水洗，或再加伊红染3～5min，蒸馏水洗后倒置于普通显微镜下随机计数（×100）13个视野内的膜下面细胞数。同时计算细胞迁移的抑制率：细胞迁移的抑制率=（对照组迁移细胞数-NDGA组迁移细胞数）/对照组迁移细胞数×100%。

3．胶质瘤条件培养基引起的迁移实验：将已制备的条件培养基CM1、CM2（含NDGA 100 μmol/L）以1 ml、2 ml的量加入12孔培养板内，补加含0.5%新生小牛血清 的 M199培养基，使每孔2 ml。消化内皮细胞，调其浓度为1×10⁵个/ml，每个小室内加入0.1 ml(1×10⁴个细胞)，轻振荡，入孵箱内培养6 h取出，后续处理步骤，方法同上。

四、数据统计学处理

数据以均数±标准差(x±s)表示, 采用Microsoft Excel提供的统计程序,进行t检验。

结果

1．NDGA对SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达的影响：SHG-44细胞VEGF、bFGF 蛋白表达均较强，主要定位于瘤细胞的胞质。NDGA处理细胞1～3 d后，SHG-44细胞VEGF、bFGF 蛋白表达的阳性减弱, 如图2～5。

2．NDGA对内皮细胞的移行和胶质瘤细胞诱导的内皮细胞迁移的影响：传入微孔滤膜培养小室的内皮细胞与在培养板内相似，可很快贴壁生长。当下室无SHG-44细胞时，移行至膜下的内皮细胞多在10个左右。当下室有SHG-44细胞存在时，迁移的细胞数明显增加（图6）。而经100 μmol/L NDGA处理24 h后，内皮细胞的迁移数较对照组明显减少（图7），差异有显著性（图8，P＜0.01）。当下室有一定量的胶质瘤细胞存在时，50、100、150和200 μmol/L的NDGA处理组迁移抑制率分别为12.0%，37.4%，86.7% 和82.2%；迁移的内皮细胞数随NDGA浓度的增加而减少，除50 μmol/L NDGA组外，与对照组比差异均有显著性（图9，P＜0.05）。

3．NDGA对胶质瘤细胞条件培养基诱导的内皮细胞迁移的影响：加入条件培养基对内皮细胞作用6 h后，CM1表现出对内皮细胞更强的吸引作用，细胞计数显著高于CM2组，差异有显著性（P＜0.01），说明在存在NDGA（100 μmol/L）的情况下，SHG-44细胞产生的迁移因子减少，对内皮细胞的诱导作用减弱，而CM含量多少之间也显示出明显差异，见图10。

图2对照组48 h SHG-44细胞VEGF蛋白表达较强SP法×200图3NDGA组48 h SHG-44细胞VEGF蛋白表达减弱SP法×200图4对照组72 h SHG-44细胞bFGF蛋白表达强SP法×400图5NDGA组72 h SHG-44细胞bFGF蛋白表达减弱SP法×400图6SHG-44细胞与ECV-304细胞联合培养，见较多迁移至微孔滤膜(→)下面的内皮细胞(EC)苏木素染色×200图7SHG-44细胞与ECV-304细胞联合培养，并加入NDGA，见少数散在迁移至微孔滤膜(→)下面的内皮细胞(EC)苏木素染色×200

图8NDGA对内皮细胞迁移的影响

图9不同浓度NDGA对内皮细胞迁移的影响

图10胶质瘤细胞条件培养基对内皮细胞迁移的影响

讨论

NDGA作为脂氧化酶的强抑制剂具