中国医学科学院学报1999年第21卷第3期

宋阳许增禄崔丽刘霄徐健钱晓菁黄玉苓

摘要目的研究小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布。方法应用生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光法和原位杂交法检测幼年、成年及老年小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布的变化。结果小鼠睾丸支持细胞具有合成Ⅳ型胶原的功能，小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的含量及支持细胞内Ⅳ型胶原mRNA水平随小鼠年龄的增加而变化。15天幼鼠睾丸内含量最高，成年及老年小鼠睾丸内含量依次减少。结论睾丸内的细胞外基质可能在生精过程中起重要作用。

关键词：胶原睾丸间接免疫荧光原位杂交

睾丸内的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要包括纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、层粘连蛋白(laminin，LN)、巢蛋白(entactin)、SPARC(secreted protein，acidic，and rich in cysteine)、蛋白多糖和Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原等^［1～4］，与精子发生和生精细胞的分化具有密切关系，曲细精管基膜是睾丸内ECM的主要分布位置，Ⅳ型胶原是基膜内含量最丰富的ECM成分。在睾丸内，支持细胞(Sertoli cell，SC)和管周肌样细胞(Peritublar cell，PC)可以产生ECM^［5］。本研究采用生物素-抗生物素蛋白DCS(avidin D cell sorter)体系间接免疫荧光法和原位杂交法检测各年龄段小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布，以阐明ECM在生精过程中的重要作用，并试图对其作用机制进行初步探讨。

1材料和方法

实验分组体内实验：实验动物为昆明小鼠，按年龄分为4组：(1)新生鼠，出生后5 d; (2) 幼鼠，出生后15 d； (3) 成年鼠，3个月； (4) 老年鼠，18个月。体外实验：培养的支持细胞来自出生后10 d的昆明小鼠。各年龄段使用动物数8～12只。

支持细胞的分离与培养支持细胞分离参照Hadley等^［6］方法进行。用培养液悬浮细胞，用吸管将细胞接种在有盖玻片的培养瓶内，于31℃，5%CO₂条件下培养10～14 d。分离培养的细胞存在核卫星小体，可鉴定为支持细胞。

生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色

组织切片的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色：参照许增禄^［7］法。应用兔抗小鼠Ⅳ型胶原为第一抗体，生物素化的山羊抗兔IgG为第二抗体。染色后滴加甘油封片剂(含10%PBS和1%对苯基二胺)封片，OLYMPUS反射式荧光显微镜下观察，Kodak 400ASA胶卷照相。

体外培养的SC生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色：将长有SC的盖玻片从培养瓶内取出，D-Hank液洗1次，放入丙酮固定20 s，PBS洗2次，每次5 min，然后加用PBS配制的10%山羊血清于4℃孵育20 min，以下操作同上。

原位杂交

cDNA探针的制备：含小鼠α1(Ⅳ)cDNA(1.8 kb)的重组质粒PE123由预防医学科学院劳动卫生研究所刘秉慈教授惠赠。按文献^［8］方法转染细菌后，大量制备质粒，用相应内切酶酶解质粒后，再用低融点琼脂糖法回收cDNA片段。

缺口平移法标记探针：应用缺口平移试剂盒(华美公司)，依照说明书将α-³⁵S-dATP标记到探针上，标记探针经Sephadex G-50柱层析后回收，标记探针的比活性达2.78×10⁶Bq/μg。

组织cDNA-mRNA原位杂交：采用林月珍等^［9］方法。

新鲜睾丸组织制成冰冻切片，经原位杂交后，放射自显影及HE复染，树胶封片，OLYMPUS光学显微镜观察，Kodak 100ASA胶卷照相。

体外培养的SC的原位杂交：将长有SC的盖玻片从培养瓶内取出，直接放入PBS配制的4%多聚甲醛中固定20 min，以下操作同组织cDNA-mRNA原位杂交。

阴性对照标本的设置：

A.杂交液中无标记探针的空白对照。

B.以标记的λDNA代替目的探针。

原位杂交结果的半定量及统计学处理：每个动物取1张切片，则每个年龄组为8张切片，在每张切片上取左上、右上、中、左下、右下5个区域(n=40)，在400×下计数银颗粒数，结果以银颗粒数/10000 μm²表示。实验数据以均数±标准差(±s)表示，用t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有显著性意义。

2结果

细胞免疫化学结果

组织切片的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色结果：5天小鼠曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光最弱，呈薄层状围绕曲细精管，血管基膜处亦有荧光存在(图1a)，15天小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光最强(图1b)，3及18个月小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光依次减弱(图1c)。对照染色标本未见荧光。

图1Ⅳ型胶原抗体在小鼠睾丸冰冻切片上的间接免疫荧光染色结果

fig 1Immunofluorescent photomicrograph of frozen section of testis in mouse stained with antibody

against type Ⅳ collagen ×200

a．5-day-old mouse; b．15-day-old mouse; c．18-month-old mouse

体外培养SC的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色结果：体外培养的SC胞质内和胞膜上可见中等强度的Ⅳ型胶原的荧光，胞核处无荧光(图2)。对照染色标本未见荧光。

图2Ⅳ型胶原抗体在培养小鼠睾丸SC上间接免疫荧光染色结果

fig 2Immunofluorescent photomicrograph of cultured SC stained with antibody against type Ⅳ collagen ×200

原位杂交结果

组织切片的原位杂交结果：杂交银颗粒主要位于小鼠睾丸支持细胞胞质内。15天小鼠睾丸内Ⅳ型胶原cDNA-mRNA杂交银颗粒密度最高(图3a)，3和18个月小鼠睾丸内杂交银颗粒密度依次减弱(图3b)。阴性对照实验几乎看不见杂交银颗粒。

图3原位杂交法显示小鼠睾丸内Ⅳ型胶原α₁(Ⅳ)mRNA的分布(以Ⅳ型胶原α₁(Ⅳ)cDNA为探针)

fig 3Distribution of type Ⅳ collagen α₁(Ⅳ) mRNA in testis in mouse，as detected by in situ hybridization with type Ⅳ collagen α₁(Ⅳ) cDNA probe ×400

a．15-day old mouse; b．18-month old mouse

体外培养的SC的原位杂交结果：体外培养的SC胞质内可见较高密度的Ⅳ型胶原cDNA-mRNA杂交银颗粒(图4a)，阴性对照实验几乎看不见杂交银颗粒(图4b)。

图4原位杂交法显示培养小鼠睾丸支持细胞内Ⅳ型胶原α₁(Ⅳ) mRNA的分布(以Ⅳ型胶原α₁(Ⅳ) cDNA为探针)

fig 4Distribution of type Ⅳ collagen α₁(Ⅳ) mRNA in cultured SC，as detected by in situ hybridization with type Ⅳ collagen α₁(Ⅳ)cDNA probe ×400

a．positive signals; b．negative control

原位杂交结果的半定量及统计学处理：15天、3和18个月小鼠银颗粒数分别为(492.98±63.48)、(248.85±42.70)和(177.53±40.54)/10000 μm²，3个月与15天比较P＜0.001，18个月与3个月比较P＜0.001。

3讨论

Ⅳ型胶原为小鼠睾丸基膜中含量最丰富的ECM成分，它形成基膜的结构网架。基膜中最常见的分子组成是［α₁(Ⅳ)］₂ α₂(Ⅳ)，为三螺旋型的三聚体^［10］。由于基膜中Ⅳ型胶原分子含两条α₁(Ⅳ)链，所以本研究原位杂交所用的探针为α₁(Ⅳ) cDNA探针，这样可以较高效率地检测出小鼠睾丸基膜中Ⅳ型胶原的mRNA水平。Ⅳ型胶原是基膜中最主要，也是含量最丰富的ECM成分，而基膜又是ECM的特殊型，本研究进一步探讨小鼠睾丸中基膜的组成和功能是否随年龄而变化。

小鼠睾丸中ECM随小鼠的年龄而变化，小鼠睾丸的发育、生长、成熟、衰老都离不开ECM的参与和作用。胚胎12.5 d时，SC和前精原细胞一起从生精索分化出来。此时，发育着的生精索通