关键词: 固定化， 低聚果糖， 聚乙烯醇， 黑曲霉， 葡萄糖异构酶

摘要目的：研究固定化黑曲霉细胞与葡萄糖异构酶协同反应生产高含量低聚果糖的优化条件。方法：以磷酸化的PVA-海藻酸钙为载体包埋黑曲霉细胞，与固定化的葡萄糖异构酶协同反应，以蔗糖为原料转化生产低聚果糖。结果：7.5%PVA，1.0%海藻酸钠包埋10%黑曲霉细胞，在pH 6.7的饱和硼酸-0.75%BaCl₂中成型，于0.7 mol/L NaH₂PO₄中强化1 h。与固定化的葡萄糖异构酶一同在50℃，pH 7.0条件下与40%蔗糖溶液反应3.5 h。重复反应5批，平均转化率为57%。结论：用优化条件制得的固定化细胞与葡萄糖异构酶协同转化生产低聚果糖，重复利用性好，且转化率高于单独使用黑曲霉。

中图分类号Q-33

Production of High-content Fructooligosaccharides with Immobilized

Aspergillus niger and Glucose Isomerase

Gao Fang, Qin Keliang, Zhao Yuxiu, Fan Qiuyu, Wu Zhilong, Yang Guangli

(Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200040)

AbstractPurpose：The aim is to study the optimal co-reaction condition of producing high content fructooligosaccharides(FOS) for immobilized cells and glucose isomerase.Methods:Aspergillus niger cells entrapped by modified phosphorylated polyvinyl alcohol(PVA)-alginate gel co-react with immobilized glucose isomerase to transfer sucrose to FOS.Results:10% cells entrapped by 7.5% PVA and 1.0% alginate are solidified in saturated boric acid-0.75% BaCl₂ with pH 6.7 and strengthened in 0.7 mol/L Na₂HPO₄.The immobilized cells were co-reacted with immobilized glucose isomerase at 50℃,pH 7.0 for 3.5 hours.After 5 batches were repeated,the FOS average conversion rate was 57%.Conclusion:In the reaction system which is composed of the cells entrapped with optimal conditions and immobilized glucose isomerase,the re-utilization ability is good and conversion rate is higher than that of the solo immobilized-cell-reaction.

Key wordsImmobilized, Fructooligosaccharides, Polyvinyl alcohol, Aspergillus niger, Glucose isomerase

低聚果糖(Fructo-oligosaccharides,FOS)是一种具有很大发展潜力的食品添加剂。工业上通常是利用微生物中的β-呋喃果糖苷酶，以蔗糖为底物转化生产的。由于反应中副产物葡萄糖的存在，抑制了底物蔗糖的进一步转化，故反应液中低聚果糖含量不高，约有50%。为了提高转化率，Yun等^［1］在反

应中加入葡萄糖氧化酶，将副产物葡萄糖氧化为葡萄糖酸，从而促使蔗糖进一步转化为低聚果糖。也有利用葡萄糖异构酶，将葡萄糖转化为果糖，消除产物抑制，得到较高含量的低聚果糖^［2］。

本文用改进的PVA-硼酸法包埋黑曲霉，与葡萄糖异构酶协同作用，提高了低聚果糖转化率，并探索了固定化及转化反应的优化条件。

1材料

菌种：黑曲霉(Aspergillus niger SIPI-630)，上海医药工业研究院生物制药事业部；固定化葡萄糖异构酶(365 u/g)，Novo Nordisk公司。

2方法

2.1固定化葡萄糖异构酶的活性测定

活化：固定化酶1 g加到葡萄糖溶液(含葡萄糖45%、MgSO₄*7H₂O 0.1%、Na₂S₂O₄ 0.018%，用碳酸钠调pH至7.5，下同)10 ml中活化45 min，前15 min每5 min搅拌一次。

反应：葡萄糖溶液40 ml加入固定化酶1 g，60℃，200 r/min，密封反应30 min。取反应液1 ml加到0.5 mol/L高氯酸溶液1 ml中终止反应。

测定：将上述溶液稀释400倍，取1 ml，用咔唑法^［3］测果糖。在上述条件下每分钟产生1 μmol果糖所需酶量定义为一个单位。

2.2普通PVA-硼酸固定化方法

含7.5%聚乙烯醇(PVA)、1.0%海藻酸钠、10%黑曲霉菌体的溶液在饱和硼酸-0.75%BaCl₂中成型2 h，蒸馏水冲洗后在pH 6.0、0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中冷藏备用。

2.3改进的PVA-硼酸固定化方法

6%～9%的PVA、0.75%～1.5%海藻酸钠与黑曲霉干菌体(最终浓度10%)混合均匀，滴入饱和硼酸-BaCl₂溶液中(BaCl₂浓度0.75%～1.5%，pH 6.0～6.7)，反应2 h，移至NaH₂PO₄溶液中(0.3～0.7 mol/L)，反应1 h。蒸馏水冲洗后置pH 6.0、0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中冷藏备用。

2.4固定化细胞中β-呋喃果糖苷酶酶活的测定方法

反应条件：在50%、pH 6.0，0.05 mol/L(Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液)蔗糖溶液100 ml中加入含菌体1 g的固定化细胞，40℃、200 r/min反应20 min；沸水加热15 min终止反应。在上述条件下每分钟产生1 μmol的蔗果三糖所需的酶量定义为一个单位。

2.5固定化细胞的转化率测定

反应条件：将蔗糖50 g加到pH 6.0，0.05 mol/L Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液(最终浓度约为38.4%)100 ml，配成蔗糖反应液；含干菌体3 g的固定化细胞加入到40 ml蔗糖溶液中；50℃，振荡速度200 r/min条件下反应3.5 h；沸水加热15 min终止反应。

2.6固定化细胞与固定化酶的协同反应

在pH为7.0，含40%蔗糖、0.5%MgSO₄的反应液中加入固定化细胞和固定化异构酶。固定化细胞含干菌量(g)∶固定化酶量(g)∶反应液量(ml)=3∶1∶40。50℃，200 r/min下反应3.5 h。

3结果及讨论

3.1普通PVA-硼酸法制得的固定化细胞的重复利用性

固定化细胞在60℃，转速为200 r/min的水浴中反应2.5 h后测定转化率。结果见图1。可见，用此法制得的固定化细胞在重复利用过程中，活力损失很大。故此法不适合本反应系统。

3.2改进的PVA-硼酸法中各种因素对固定化细胞活力的影响

3.2.1饱和硼酸-BaCl₂溶液的pH对固定化细胞活性的影响将饱和硼酸-BaCl₂溶液分别用5 mol/L NaOH溶液调pH 6.0、6.4、6.7。其它固定化条件不变，测定固定化颗粒的酶活。结果表明pH 6.7一组的固定化细胞酶活最高，在60℃考察三组颗粒的强度，pH 6.7一组的颗粒最好。

3.2.2饱和硼酸溶液中BaCl₂浓度对固定化细胞活性的影响设定饱和硼酸溶液中BaCl₂浓度分别为0.5%、0.75%、1.0%，pH定为6.7。其它固定化条件不变，测定固定化颗粒的酶活。当BaCl₂的浓度为0.75%时，固定化细胞的活性最高。

3.2.3NaH₂PO₄溶液的浓度对固定化细胞活性的影响NaH₂PO₄溶液可与PVA发生酯化作用，对其热稳定性有很大影响，我们发现，没经NaH₂PO₄溶液处理的凝胶颗粒在50℃以上极不稳定。将按上述较优条件制得的固定化细胞分别用0.3、0.5、0.7 mol/L的NaH₂PO₄溶液继续处理1 h后，测定固定化细胞的酶活。NaH₂PO₄的浓度为0.7 mol/L时，固定化细胞活性最高。

3.2.4海藻酸钠浓度对固定化细胞活性的影响海藻酸钠的浓度分别为0.5%、0.75%、1.0%，滴入pH 6.7含0.75%BaCl₂的硼酸溶液中，再用0.7 mol/L的磷酸溶液处理，其它反应条件不变，测定固定化细胞酶活。实验表明海藻酸钠浓度为1.0%时，固定化细胞活性最高。

3.2.5PVA浓度对固定化细胞活性的影响设定PVA的浓度为6.0%、7.5%、9.0%，海藻酸钠浓度为1.0%，其它条件同上。实验中发现含9.0%PVA的一组粘度很大，在硼酸溶液中不易成型。当PVA的浓度为7.5%时，固定化细胞的活性最高，因此选择PVA的浓度为7.5%。PVA浓度过高影响传质，而过低则导致交联度降低，细胞漏出。

3.3固定化细胞与固定化葡萄糖异构酶协同反应的条件

3.3.1转化反应的pH对低聚果糖转化率的影响由于固定化异构酶的最适pH为7.5(产品说明书)，而黑曲霉中的β-呋喃果糖苷酶的最适pH为5.5～6.0，因此选择pH 6.0～7.5为反应条件。配制4份Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5。加入MgSO₄*7H₂O，使浓度达到0.5%。用上述缓冲液分别配制40%的蔗糖溶液各26.7 ml作为反应液，在55℃，200 r/min条件下反应2.5 h，测定转化率。结果显示当pH为7.0时，协同反应的转化率最高。

3.3.2转化反应的温度对低聚果糖转化率的影响将固定化细胞和固定化酶分别在50℃、55℃、60℃，pH7.0下反应2.5 h。其它条件同上，测定转<