关键词: 胰岛素原， 类似物， 人胰岛素原， 重组

摘要目的：获得更佳的变复性条件和提高人胰岛素原的重组率。方法：采用特有的重组方法，将小C肽人胰岛素原类似物(B-Arg-Ar g-A)与人胰岛素原(B-C-A)进行重组条件的比较。结果：发现二者 在pH10.6左右处重组率达到最大，且在相同的条件下B-Arg-Arg-A蛋白质的重组率(94%) 较B-C-A蛋白质(82%)的高。结论：进一步验证了“胰岛素的A、B链 含有足够使二硫键正确配对的结构信息”的论点。

中图分类号Q578

Study on the Recombining Conditions Between A and B Chains of

“Mini-C” Human Proinsulin Analog and Human Proinsulin

Chen LaitongZhang MingjunHu Meihao

（National Laboratory of Protein Engineering,Peking University Beijing 1008 71）

AbstractPurpose：The aim is to obtain the best conditions of r eduction and oxidization and to raise the recombinating rate of human Proinsulin .Meth ods:“Mini-C” human Proinsulin Analog(B-Arg-Arg-A) was compared with human Proinsulin(B-C-A) by specifical methods of recombination.Results:[ WTBZ]It showed that the recombination ratio of both proteins reached a maximum in pH 10.6.However under the same conditions, the recobination ratio of B-Arg -Arg-A(94%) was higher than that of B-C-A(82%).Conclusion:The se experiments also proved that A and B chains of insulin involve enough structu ral information about the correct pairing of the disulfide bonds.

Key wordsProinsulin, Analog, Human Proinsulin, Recombination

在研究胰岛素的结构与生物功能的关系中，过去人们一直认为C肽含有 使胰岛素二硫键正确配对足够的结构信息^［1,2］。我国科学家在成功地解决胰岛素 的A、B 链重组问题^［3］及随后对交联胰岛素的研究^［4～6］后，人们对“C肽含有使 胰岛素二硫键正确配对的足够的结构信息”这一论点产生了质疑。

20世纪80年代至90年代，科学家对不同长度的C肽进行了研究^［7～9］，结果表明，C 肽在胰岛素A、B链正确配对时，可能只起柔性连结肽作用，使得双分子反应变为分子内反应 。而A、B链包含了足够的使二硫键正确配对的信息，C肽的长短可能对A、B链的重组产生影响。

参照Thim等^［10］在酵母表达系统中进行了不同长度C肽及去C肽胰岛素原的比较研究 ，发现C肽缩短后胰岛素原的表达量并未受影响，当C肽由4个氨基酸缩短为2个氨基酸后蛋 白表达量上升。依据短C肽及无C肽胰岛素原重组率高的研究结果，我们在获得重组小C肽人 胰岛素原类似物(B-Arg-Arg-A)的基础上，为进一步提高人胰岛素原(B-C-A)的重组 率，寻求更佳的重组条件，对B-Arg-Arg-A与B-C-A的重组条件进行了研究。

1材料与方法

1.1材料

B-Arg-Arg-A和B-C-A蛋白质样品，本实验室制备^［10］；其它所用试剂均为分 析纯试剂。

1.2方法

1.2.1B-Arg-Arg-A与B-C-A重组最适pH值的确定分别称取B-Arg-Arg-A 3 mg和B -C-A 4.9 mg，分别加入裂解液5 ml，37℃反应2 h，然后用冷水稀释5倍，立即用6 mol/L 盐酸调pH 4～5，4℃，12 000 r/min离心10 min，弃去上清液。用预冷水1 ml溶解 沉淀 ，用12 mol/L氢氧化钠调pH 11～12，紫外测定蛋白质浓度。依次将此蛋白质溶液加入到一 定体积、不同pH的0.05 mol/L Gly-NaOH重组液中，使蛋白浓度为0.9 mg/ml，4℃放置24 h，然后对重组液进行15%PAGE 电泳和对电泳胶进行紫外薄层扫描，检查重组率。

1.2.2不同浓度B-Arg-Arg-A与B-C-A变复性的比较按1.2.1项方法分别称取B-Arg -Arg-A与B-C-A，同时进行还原、稀释、沉淀和溶解，用12 mol/L氢氧化钠调至pH 11～ 12，紫外测定蛋白质浓度。将蛋白质溶液加入0.05 mol/L Gly-NaOH重组液中，配成蛋白质 浓度分别为0.1、0.3、0.6和0.9 mg/ml，4℃放置24 h，重组液进行15%PAGE电泳和对电泳胶 进行紫外薄层扫描，检查不同浓度的重组率。

1.2.3B-Arg-Arg-A与B-C-A复性过程的动力学比较按上述方法制备重组液使每管蛋 白质浓度均为16 mmol/L，各取一管B-Arg-Arg-A与B-C-A重组液，立即放入-70℃冰箱 ，终 止复性过程，记为0 h，其余于4℃继续重组，并在4、6、8、10、12、13、24、36、48、72 和96 h时各取一管B-Arg-Arg-A与B-C-A重组液放入冰箱，最后重组液进行15%PAGE电泳 和对电泳胶进行紫外薄层扫描，检查不同时间的重组率。

2结果与讨论

2.1pH对B-Arg-Arg-A与B-C-A重组率的影响

见图1。从图1可见，在相同重组条件下，B-Arg-Arg-A与B-C-A在pH 10.6处重组率均达 到最高，此时B-Arg-Arg-A的重组率较B-C-A为高。

2.2不同蛋白质浓度对B-Arg-Arg-A与B-C-A重组率的影响

见图2。可见各相同浓度条件下B-Arg-Arg-A较B-C-A具有更大的重组率，且随着蛋白 质浓度的增大，两种蛋白质的重组率均逐渐降低。

2.3B-A rg-Arg-A与B-C-A重组动力学曲线

见图3。可见在正常的重组时间内(24～48 h)，B-Arg-Arg-A重组率较B-C-A为高，且 B-Arg-Arg-A较B-C-A较早达到最大重组率，在重组液中B-Arg-Arg-A较B-C-A更稳 定。

从以上研究结果可知，B-Arg-Arg-A与B-C-A在pH 10.6，15～24 h左右处重 组率最大，由此我们认为pH 10.6为最佳重组pH值，重组时间以15～24 h为好，在此条件下 这两种蛋白质处于最佳溶解状态。B-Arg-Arg-A比B-C-A有较高的重组率，可能是由 于B-Arg-Arg-A与B-C-A相比，A、B链间的自由度要小，这与文献报道^［8］的去 B₃₀单链胰岛素比胰岛素原有更大的重组率的结论相同。C肽缩短或去除后，A、B链更 加 接近，而A、B链的折叠并未受到影响，分子内相互作用机率增强，故此验证了“A、B链包含 有足够的使二硫键正确配对的信息”的论点。

北京大学蛋白质工程国家重点实验室资助项目

参考文献

1，Givol D,Lorenzo FD, Goldberger RF,et al.Disulfide interchange and the three-dimensional structure of proteins.Proc Natl Acad Sci USA,1965,53∶67 8～684

2，Varandani PT,Annnafz M. Enzymatic destruction of immunoreactivity in proinsulin and activation of their scrambied forms.Arch Biochem and Biophy,1970, 141∶533～537

3，杜雨苍，张友尚，鲁子贤，等.从胰岛素A链及B链重合成胰岛素.生物化学与生物 物理学报，1961，1(1)∶13～24

4，Stelner F,Clark JL.Spontaneous reoxidation of reduced beef and rat pro insulins.Bichemistry,1968,60∶622～629

5，Busse W,Carpenter FH.Synthesis and proinsulin of carbonylbis(methionyl )insulin,a proinsulin analogue which is convertible to insulin by cyanogen bromi de cleavage.Biochemistry,1976,15(8)∶1649～1657

6，Wang CC,Zhou CL.The insulin A and B chain contain sufficient structura l information to form the native molecule.TIBS,1991,16∶279～281

7，Wetzel R,Goeddel DV.Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized“Mini-C” analog of human proinsulin.Gene,1981,16∶63～71

8，Markussen J.Comparative reduction/oxidation studies with single chain des-(B30) insulin and porcine proinsulin.Int J Peptide Protein Res,1985,25∶431 ～435

9，Jian GT,Zhou CL.The insulin A and B chains contain structural informa tion for the formation of native molecule.Biochem J,1990,268∶429～435

10，陈来同，胡美浩.从基因工程小C肽人胰岛素原类似物(B-R2-A)制备人 胰岛素.生物化学杂志，1995，1(1)∶1～5

11，Thim L,Fill NP.Secretion and processing of insulin precursors i n yeast.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83∶6766～6770

收稿日期1999-11-15

修回日期2000-01-25