关键词: 人白细胞介素15，高效表达，DNA重组

摘要目的：获得重组人白细胞介素15(rhIL-15)高效表达菌株。方法：经细菌脂多糖+γ干扰素活化的人外周血单个核细胞提取细胞总RNA，用RT-PCR方法扩增出编码人IL-15 cDNA的基因片段，采用pBV220表达载体，经DNA重组技术构建IL-15基因工程菌。结果：核酸序列测定与预期一致，所表达的IL-15经SDS-PAGE证明分子量约15kD，表达量占菌体总蛋白的28%，经CTLl₂细胞检测，表达产物粗提物1∶100复性后效价可达到10⁶IU/ml。结论：构建的基因工程菌为IL-15高效表达菌株。

中图分类号R378.12； Q2-33

Construction of Recombinant Human Interleukin-15 Expression Vector and Its High Level

Expression in E.coli

Sun RuiTian ZhigangWei HaimingLiu JieZhang JieFeng Jinbo

（Shandong Cancer Biotherapy Center,Shandong Academy of Medical SciencesJinan 250062）

AbstractPurpose：To obtain human IL-15 high level expression vector.Methods：Human IL-15 cDNA fragments (0.35 kb)were amplified from LPS+IFNγ-stimulated human monocytes by RT-PCR method and inserted into EcoR I/BamH I site of pBV220 expression vector which contains P_RP_L promoters and SD sequence.Results:The expression level of rhIL-15 was more than 28% of the total bacterial protein in SDS-PAGE,molecular weight was 14.4 kD.The biological activity of refolded bacterial extract(1∶100)was 10⁶ IU/ml tested by using CTLl₂ cell line.Conclusion:Recombinant human IL-15 high level expression vector has been constructed in E.coli.

Key wordHuman interleukin-15, High level expression, DNA recombination

1994年5月，美国Immunex公司和美国FDA同时报道发现体内存在一种新的可溶性T细胞刺激因子，其生物活性与白细胞介素2(IL-2)类似，但结构组成与IL-2无关，命名为白细胞介素15(IL-15)。IL-15主要富含于人胎盘和骨骼肌中，其最佳来源为粘附的外周血单个核细胞。现己发现IL-15在机体天然免疫状态的维持中占有十分重要的地位，尤其是对NK细胞的促分化效应和功能调节引起学术界极大关注^［1］。此外还发现IL-15具备一些与IL-2不同的生物学功能(如促进肌细胞发育)^［2，3］。Immunex公司的Ⅰ期临床计划主要观察IL-15对肌萎缩症和系统性粘膜炎的治疗。鉴于IL-15对免疫生物研究的理论意义和临床应用前景，本室应用成熟的技术在大肠杆菌中表达了IL-15。

1材料和方法

1.1材料

DNA限制性内切酶、T₄DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶，均为GIBCO公司产品；pBV220、大肠杆菌DH5 α，中国预防医学科学院病毒学研究所张智清教授惠赠；CTLl₂依赖细胞株，本室保存。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成根据GENEBANK报道的hIL-15的基因序列设计了一对引物，上游引物P1： 5′-GCGAATTCATGAACTGGGTGAATGTAA-

TAAG-3′，包含起始密码子ATG，外设EcoR I酶切位点；下游引物P2： 5′-GCGGATCCTTAAGAAGT-

GTTGATGAAGATTTG-3′，将终止密码子变成原核系统高频使用的强终止密码子TAA，外设BamH Ⅰ酶切位点。引物由上海生工生物工程有限公司合成和纯化。

1.2.2富含IL-15mRNA单个核细胞的制备及总RNA提取采用常规密度梯度离心方法分离正常人外周血白细胞，培养于含10%小牛血清、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液中，加入细菌脂多糖(LPS) 5 μg/ml和γ干扰素(IFN-γ) 500 u/ml，培养4 h，弃去悬浮细胞，收获贴壁的单个核细胞，经异硫氰酸胍法(GIT法)提取细胞总RNA。采用甲醛变性琼脂糖凝胶水平电泳鉴定RNA。

1.2.3RT-PCR反应逆转录反应(RT)：取细胞总RNA 5～10 μg作为模板，加入DTT 10 mmol、M-MLV 200 u、4 xdNTP(每种)0.5 mmol、下游引物P₂ 50 pmol，总反应体积20 μl，37℃作用1 h，95℃10 min灭活M-MLV。PCR反应：在RT反应产物20 μl中，加入MgCl₂ 2 mmol、4 xdNTP 0.1 mmol、上游引物P₁ 50 pmol，95℃，5 min，加入TaqDNA聚合酶2 u。PCR循环条件：94℃1 min，58℃1 min,72℃1 min,循环35次，72℃延长7 min。

1.2.4IL-15 cDNA序列测定IL-15 PCR产物电泳后，经低熔点琼脂糖回收，水饱和酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于TE中，经紫外分光光度法定量，浓度为0.5 μg/μl。由上海基康生物技术有限公司于全自动DNA序列测量仪，自正向和反向分别测定IL-15 cDNA序列。

1.2.5IL-15重组表达载体的构建如图1所示。将RT-PCR扩增后IL-15 cDNA用EcoR I和BamH I双酶切后，经低熔点琼脂糖电泳纯化回收片断，再在T₄DNA连接酶的作用下与同样酶切的pBV220载体连接，转化入DH5 α大肠杆菌，在含氨苄青霉素的选择性培养基上筛选阳性克隆。

1.2.6rhIL-15表达载体在DH5 α大肠杆菌中的表达将阳性的克隆菌株接种于2 ml含氨苄青霉素的LB培养液中，30℃活化后，1∶100接种，扩增至A₆₀₀=0.4～0.6时，于42℃诱导培养4 h，5 000 r/min离心5 min收集菌体，制备细菌粗提物，经SDS-PAGE电泳后，凝胶经激光扫描和采用Kodark Digital Science 1D分析软件对IL-15蛋白表达量和蛋白分子量进行分析。

图1rhIL-15表达载体的构建

1.2.7IL-15生物活性检测将rhIL-15包含体裂解液作1∶100复性，用IL-15依赖细胞株CTLl₂细胞及MTT法检测IL-15的生物学活性。

2结果

2.1hIL-15 mRNA的细胞总RNA

实验结果表明细胞内总RNA形成28S、18S和5S三条区带，说明RNA是完整的。

2.2RT-PCR获取hIL-15基因片段

以细胞总RNA为模板，RT-PCR扩增hIL-15 cDNA片段，产物进行琼脂糖凝胶电泳。图2显示，电泳可见一350 bp的扩增带，其大小与理论预期值一致。

图2RT-PCR扩增rhIL-15 cDNA片断

a.标准DNA分子量(100、200、300、400、500、600 bp)；b、c.RT-PCR扩增hIL-15 cDNA

2.3hIL-15cDNA序列测定

DNA序列分析结果表明，与预期结果一致。

2.4IL-15高效表达载体的构建

EcoR I/BamH I双酶切的RT-PCR产物与EcoR I/BamH I双酶切的pBV220载体连接产物转化宿主细胞DH5 α，筛选的阳性克隆经抽取质粒作酶切电泳分析证明IL-15 cDNA已准确地插入pBV220表达载体EcoR I和BamH I酶切位点之间，见图3。

图3重组质粒酶切的琼脂糖凝胶电泳分析

a.标准DNA分子量(λDNA/Hind Ⅲ)；b.pBV220 IL-15经EcoR I抗BamH I双酶切；c.pBV220 IL-15经EcoR I酶切；d.pBV220经EcoR I和BmaH I双酶切；e.pBV220经EcoR I酶切

2.5IL-15在大肠杆菌DH5 α中的表达

工程菌经表达培养，全菌裂解后进行SDS-PAGE电泳结果见图4。图4显示有一条约14～15 kD分子量的外源蛋白质表达带。SDS-PAGE电泳凝胶经激光扫描和采用Kodark Digital Science 1D分析软件对IL-15重组蛋白表达量及蛋白分子量进行分析，rhIL-15的分子量为14.4 kD，蛋白表达量为28%。

图4SDS-PAGE分析IL-15的表达

a.标准蛋白分子量；b.DH5 α/pBV220；c、d.DH5 α/pBV220

IL-15未诱导(30℃)；e.DH5 α/pBV220 IL-15经42℃热诱导

2.6rhIL-15生物活性检测

将全菌进行包含体提取后溶于含尿素8 mol/L的包含体裂解液中，经含GSSG 2 mmol/L和GSH 5 mmol/L复性液1∶100复性，用IL-2依赖细胞株CTL1₂检测，rhIL-15的生物活性为10⁶ IU/ml，即原复性液可达5×10⁷IU/ml，原发酵液可达5×10⁸ IU/L。