关键词: L-天冬酰胺酶， 鉴定

摘要目的：对重组L-天冬酰胺酶进行鉴定。方法：用基因测序、氨基酸组成分析、N-末端氨基酸测序、胰肽图谱、IEF、分子量、紫外扫描等各种实验手段对重组L-天冬酰胺酶及其天然品进行了全面比较。结果：重组产品与天然品具有同质性。结论：重组L-天冬酰胺酶具有较好的应用前景。

中图分类号R392-33

Appraisal of Recombinant L-asparaginase

Wu JingWu WutongLai LongshengLiu Jingjing

（Department of Biochemistry,China Pharmaceutical UniversityNanjing 210009）

AbstractPurpose：To give an appraisal of recombinant L-asparaginase.Methods：Various analytical techniques including gene sequencing,amino acid composition,analysis of N-terminal amino acid analysis,peptide mapping,IEF,molecular weight and UV-scanning were used.Results:The recombinant L-asparaginase had the same quality as that of native products.Conclusion:The application of recombinant L-asparaginase was promising.

Key wordsL-asparaginase, Appraisal

由于遗传学转录和翻译后水平的变化、生产和纯化过程的改变，工程菌表达的重组产品与天然品比较可能会发生结构、生物学和免疫学的某些变化。因此，重组产品的质控除保证生物活性和常规的安全性外，还应保证重组产品与天然品的同质性、各批产品的一致性，严格限制有关杂质的含量，这样才能确保产品的安全有效^［1］。

L-天冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，临床上广泛用于治疗白血病^［2］。近年来，我们实验室构建了高效表达该酶的基因工程菌并建立完善了其中试生产工艺^［3］。为综合评价重组L-天冬酰胺酶的质量，本文从多方面考察了重组产品与天然品的同质性。

1材料

1.1菌种

重组基因工程菌E.coli PKA/CPU 210009、野生菌E.coli CPU 210009,本室。

1.2酶与试剂

天然品L-天冬酰胺酶，常州生化千红制药有限公司；重组L-天冬酰胺酶，本室提供；胰蛋白酶(序列分析纯)，德国宝灵曼公司；三氯乙酸，美国Merck公司。

1.3仪器

ABI PRISM^TM 377 DNA Sequencer,日本；Beckman porton LF 3200 protein/peptide,美国；Perkin-elmer lambda UV/VIS speltrumeter,日本；Pharmacia LKB multiphor Ⅱ，美国；日立835-50型氨基酸分析仪。

2方法

2.1重组质粒测序

从工程菌中提取质粒，用Nco I、Hind Ⅲ酶切，经电泳证明有插入片段，以此质粒上的相关基因正反测序。测序使用引物：

R Primer(ZG259b) 5′-GAGCGGATAACAATT

TCACACAGG-3′

F Primer(ZG259b) 5′-GCTTCTGCGTTCTGA

TTTAA-3′

R₁ 5′-TAATCGTGGCGTGCTGGT-3′

R₂ 5′-ACCAGCACGCCACGATTA-3′

2.2野生菌E.coli CPU 210009的产酶基因测序

测序使用引物：

ZG 284P1 5′GCACTTGCCGCACTGGTT-3′

ZG 284P2-2 5′-GCTTGAGAATGCCGTGAT-3′

ZG 259R15′-TAATCGTGGCGTGCTGGT-3′

ZG 259R25′-ACCAGCACGCCACGATTA-3′

以ZG 284P1、ZG 284P2-2对细菌染色体进行PCR扩增，PCR产物经精制后，使用Bigdye试剂盒顺序。

2.3肽图分析

样品的处理样品经脱盐、冻干，1%NH₄HCO₃溶解至1.0 mg/ml，按1∶30(W/W)加入胰蛋白酶，37±0.5℃保温16 h，50%冰醋酸终止反应备用。

色谱条件流动相：A为0.1%TFA 水，B为0.1%TFA，乙腈∶水(80∶20)。梯度：0～60 min，B：0～30%；60～120 min，B：30%～38%；120～175，B：38%～80%。流速：0.2 ml/min；上样量：自动进样50 μl；检测波长：210 nm。

2.4SDS-PAGE电泳、等电聚焦电泳

按参考文献［4］方法进行。

2.5氨基酸组成分析

酸解：6 mol/L HCl,110℃，18 h；碱解：4 mol/L NaOH,110℃,18 h;Cys采用过甲酸氧化成半胱磺酸后6 mol/L HCl，110℃，18 h测定。

图1重组质粒和野生菌的测序结果

3结果

3.1基因水平的鉴定

基因测序结果见图1。从图1可见，重组质粒和野生菌上的相关产酶基因序列一致，即基因工程菌产生的天冬酰胺酶与天然酶在基因水平上一致。

3.2N-末端氨基酸分析

对蛋白质的全氨基酸序列分析，难度大，耗时长，从统计学观点只要测定N-末端15个氨基酸便可保证其顺序的正确性。故N-末端15个氨基酸序列分析可作为重组蛋白质的重要鉴别指标。测定结果见图2。从图2可见，重组产品的近氨基端序列与来源于其出发菌株E.coli As1.357者一致，与来源于E.coli ATCC9637者比较有一个残基的差别，即V-12而不是T-12^［5］。

图2不同E.coli来源的天冬酰胺酶N-末端氨基酸比较

3.3肽图分析

肽图分析是rDNA产品质控的重要手段之一。通过肽图分析，可从一级结构研究重组产品与天然品的同质性。本文用RP-HPLC(C₈)法检测重组产品与天然产品经胰蛋白酶裂解后的肽图谱。结果见图3、4。由图中可见，重组产品与天然产品具有相同的指纹图谱，它们具有相同的一级结构。进一步验证了它们的同质性。

图3重组天冬酰胺酶的胰肽图谱

图4对照品(天然天冬酰胺酶)的胰肽图谱

3.4分子量测定

应用还原型的SDS-PAGE测分子量，结果见图5。从图中可见，重组品与天然品分子量一致。测出的分子量为135 184(33 796×4)。与理论数据基本一致(误差不超过2%)。

图5还原型SDS-PAGE测定分子量电泳图

1、3.重组产品； 2、4.protein marker

3.5紫外扫描

这是基因工程药物的一个重要物理常数，对于一个蛋白质来说，它的最大吸收波长是固定的。测定结果见图6。样品在蒸馏水、0.1 mol/L NaOH溶液中的最大吸收波长分别为278、291 nm。与孟广震等^［6］对原野生菌所产天然酶的研究结果一致。

图6重组L-天冬酰胺酶的紫外扫描图谱

——水溶液； －－－0.1mol/L NaOH溶液

3.6等电点测定

等电聚焦具有很高的分辨率，可将pI相差0.01～0.02 pH单位的蛋白质分开，因而是一种有效的鉴别手段。测定结果见图7。从图中可见重组产品与天然品pI一致，为4.85，而日本进口产品的等电点为4.75。

图7L-天冬酰胺酶的等电聚焦图谱

1.日本标准品；2.天然产品；3.等电点标准蛋白；4～6.样品

3.7氨