首都医科大学学报2000年第21卷第4期

熊英刘华于培兰张澄波杨慧徐群渊

提要：设计合成含适当酶切位点的PCR引物，以人的全长THcDNA为模板，进行PCR扩增反应，得到人酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）全长及催化核心序列，将其分别插入谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1,转化入大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达，SDS-PAGE、western blotting分析表达产物。结果获得了编码N-端缺失145个氨基酸的酪氨酸羟化酶催化结构域的cDNA片段及带一定内切酶识别位点的全长片段，表达载体构建正确。插入片段序列与人THmRNA相应序列完全一致。转入重组质粒的菌经诱导后，有相对分子质量约为8.3万及6.6万的外源融合蛋白表达，并得到较纯的酶蛋白。

关键词：酪氨酸羟化酶；表达；催化核心；全长序列

酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是儿茶酚胺类神经递质合成过程中的限速酶，催化酪氨酸转变成L-多巴（L-DOPA），常被用来作为帕金森病(Parkinson disease，PD)基因治疗时的目的基因^［1］。因此植入脑内的外源性TH基因能否高效表达酶的活性是基因治疗PD有无疗效的关键。本研究拟在原核表达系统中表达人TH全酶及催化核心，如能证实后者的活性的确高于前者，则可为PD治疗提供更有效的手段。

1材料和方法

1.1材料

质粒与菌种:pRrchTH质粒由Somatix Therapy Corporation提供，pGEX-4T-1质粒、大肠杆菌BL21购自Amersham parmacia公司。

酶与化学试剂:PCR引物由赛百盛生物工程公司合成，AccuPower^TM pCR Premix试剂盒购于Bioneer公司，限制性内切酶、T₄ DNA连接酶购于华美公司，Glassmilk kit购自原平皓公司，质粒快速提取试剂盒购自博大科技公司，IPTG、抗TH单克隆抗体为Sigma公司产品。其余试剂均为分析纯试剂。

1.2方法

1)PCR扩增DNA片段：对于TH全长序列及根据大鼠TH催化结构域对应的DNA碱基序列(2～4)推导出的人TH所对应的催化结构域的碱基序列，设计出特定的引物，进行PCR扩增反应。

2)DNA重组克隆及其鉴定：质粒提取、酶切反应、电泳分析、DNA回收、连接反应、细菌转化等均参照文献［2］略作修改进行。DNA测序采用Sanger双脱氧终止法，由TaKaRa bio公司测定。

构建的表达质粒相应地分别命名为pGEXTHa、pGEXTHc。

3)基因表达：参照文献［2］中GST融合蛋白的表达方法进行。

4)表达产物溶解性分析：取诱导后破菌上清蛋白样品及诱导后破菌沉淀蛋白样品进行SDS-PAGE分析表达产物的溶解性。

5)融合表达产物的亲和层析纯化：在10倍体积的PBS中预溶胀S-连接谷胱甘肽-琼脂糖凝胶珠1 h，然后用PBS洗涤2次，以PBS按50%比例重悬，该糊状琼脂糖凝胶于4℃保存备用。

取适量诱导后破菌上清蛋白样品，加入1/10体积的50%谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液，室温下轻柔混匀5 min，加与上清蛋白样品等体积PBS，用涡旋混合器短暂振荡旋起，高速离心5 s，收集琼脂糖珠，弃去上清。重复用PBS洗涤2次。往洗过的琼脂糖珠中加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5 min，各取20μL 上样，进行SDS-PAGE分析表达产物的纯化情况。最后进一步用western blotting鉴定表达产物。

2结果

2.1人THacDNA及THccDNA的获得

根据Genbank中人TH2mRNA的基因序列，以及大鼠TH催化结构域对应的DNA碱基序列推导出的人TH催化结构域的碱基部位，设计的引物为：

引物1：5' TTAGGATCCATGCCCACCCCCGACGC 3'引物2：5' TTAGGATCCGCCGCCCTGCTCAGTGG 3'引物3：5' TTGAATTCCTAGCCAATGGCACTCAG 3'

引物1为全长序列5'端引物，在其中引进了1个BamH1酶切位点，引物2为催化结构域序列5'端引物，也包含1个BamH1酶切位点，由于采用融合表达载体，所以不必另加入起始密码子。引物3为上2段序列共用的3'端引物，在其中引进了1个EcoR1酶切位点，且包含终止密码子TAG的互补序列CTA。

以质粒pRrchTH上人的全长TH₂cDNA为模板，用上述一对半引物进行PCR扩增反应，通过琼脂糖电泳分析扩增产物，分别获得1.5 kb的人TH全长序列cDNA条带和1.05 kb的催化结构域序列cDNA条带，两端均带有所设计的工具酶识别位点。

2.2表达质粒的构建及鉴定

经前述方法构建的重组质粒pGEXTHa和pGEXTHc，长度分别为6.45 kb及6.00 kb。对于质粒pGEXTHa，以Pst1单切后，产生4.15 kb及2.30 kb片段，证明其中的外源基因插入方向正确（图1）。对于质粒pGEXTHc，以EcoR1和Pst1双切后，产生约5.04 kb及0.96 kb的片段，证明其中的外源基因插入方向正确（图2）。

2.3THacDNA及THccDNA的序列分析

图1酶切图谱鉴定重组体pGEXTHa

1：pGEXTHa质粒;M₁：λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker)；2、4、5、6：pGEXTHa/Pst1单酶切正向插入产物；3：pGEXTHa/Pst1单酶切未见正确片段，舍弃；M₂：λDNA/HindⅢ(Marker)

图2酶切图谱鉴定重组体pGEXTHc

1：pGEXTHc质粒；M₁：λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker)；2、3、4、5、6：pGEXTHc/ pst1+EcoR1双切正向插入产物；M₂：λDNA/HindⅢ(Marker)

对于载体pGEX-4T-1，合成1对测序引物，用双脱氧法对插入片段进行DNA序列分析，再与人THmRNA相应序列(genbank91120)比较，测序结果与THmRNA相应序列完全一致。

2.4人TH全长及核心片段基因在大肠杆菌中表达

将上述构建的重组表达质粒分别转化大肠杆菌BL21，进行IPTG诱导的表达研究。在37℃条件下诱导表达2～3 h，表达产物用含12%凝胶的SDS-PAGE检测。结果显示，两重组菌克隆分别比各自相应的对照及未经诱导者多出1条新生深染条带，含TH全长基因的重组菌中新生深染条带相对分子质量约为8.3万，含TH核心片段基因的重组菌中新生深染条带相对分子质量约为6.6万，与预期的GST-THa、GST-THc融合蛋白大小相符（见图3）。取诱导物进行的分级分离电泳显示，表达产物主要为可溶性蛋白（见图3的2、3、7、8）。

2.5融合蛋白表达量的测定及纯化鉴定

对蛋白电泳结果进行光密度扫描，显示GST-THa、GST-THc融合蛋白主要存在于诱导后破菌上清蛋白样品中，分别约占细菌可溶性总蛋白的10.59%和12.47%，诱导后破菌沉淀中亦有少量目的蛋白。2种上清蛋白样品经亲和层析纯化，纯度分别为87.63%和90.18%(图3的6、1)。进一步以western blotting鉴定，GST-THa融合蛋白可见明显表达条带，证明所表达产物的确是TH蛋白，而GST-THc融合蛋白未见明显条带，可能是由于N-端缺失影响其与TH单克隆抗体的结合所致。

图3GST-TH融合蛋白的表达

1：纯化的GST-THc融合蛋白;2：pGEXTHc诱导后破菌上清;3：pGEXTHc诱导后破菌沉淀;4：pGEXTHc未诱导表达;5：pGEX-4T-1表达产物;6：纯化的GST-THa融合蛋白;7：pGEXTHa诱导后破菌上清;8：pGEXTHa诱导后破菌沉淀;9：pGEXTHa未诱导表达;M：蛋白质相对分子质量标准

3讨论

TH分子由N-端调节结构域和C-端催化结构域组成，对TH用蛋白酶进行限制性水解可以提高酶的活性^［3］，即野生型酶一旦切去了包含磷酸化位点的N-端调节结构域，TH就成为有活性的形式^［4，5］。Kaufman等提出了真核生物中存在有TH的翻译后调控机制^［6～8］，推测TH的N-端调节结构域对酶活性起抑制作用，认为TH全酶可与其反馈抑制剂儿茶酚胺类化合物紧密的结合，从而限制了酶与底物的结合，影响酶的活性。相反，如切去包括磷酸化位点在内的调节结构域，可引起酶的构象改变，有利于底物进入酶的活性中心，激活酶的催化活性。人TH含有4种亚型，即TH₁、TH₂、TH₃和TH₄，其中TH₁催化活性最高，另外3种的活性是其的30%～50%。而与TH₁cDNA相比，其他3种THcDNA在90～91碱基之间分别具有12、81和93bp的插入序列，它们的催化核心序列则完全相同。据此推测上述插入序列的存在可能抑制了酶的活性^［9］。Nagatsu发现不同动物的TH氨基酸顺序存在着高度保守性，均包含可被蛋白激酶磷酸化的调节结构域以及可与底物酪氨酸、分子氧和辅因子四氢喋啶(BH₄)结合并具有催化活性的催化结构域^［10］。