温州医学院学报2000年第30卷第4期

毛孙忠严哲陈石根

摘要目的:建立一种高效的蚯蚓纤溶酶(EFE) 的分离纯化技术，并研究其特性。方法:蚯蚓经组织匀浆、缓冲液抽提与选择性热变性，再经抑制剂1，6-己二胺(HD)偶联的Sepharose4B亲和层析，DEAE-Sepharose离子交换层析。结果及结论:分离纯化得到具有强烈纤溶活性的酶组分(EFE-F₁、₂，EFE-F₃)。其中EFE-F₃对合成底物S-2288和Chromozym p的Km分别是0.01mmol/L和0.02mmol/L，HD的Ki为1mmol/L；该酶热稳定性强，能抗4mol/L脲。

关键词：蚯蚓纤溶酶；酶抑制剂；分离纯化

蚯蚓种类繁多，具有广泛的药用价值。在蚯蚓组织抽提液中存在高活性的纤溶酶成分，在临床上有重要意义。目前该酶的分离纯化方法虽多，但繁复且效率不高。我们在胰蛋白酶抑制剂的研究中，发现1，6-己二胺（1，6-hexamethylendiamine，HD）对蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzymes，EFE）具有抑制作用，在此基础上用HD-Sepharose4B亲和层析法对该酶进行了较为理想的分离纯化，同时对其动力学性质进行了研究，现报告如下。

1材料和方法

1.1材料与试剂

1.1.1蚯蚓：正蚯科（Lumbricidae)双胸蚓科(Bimastos)。

1.1.2主要试剂：Sepharose 4B，DEAE-Sepharose系Pharmacia产品，HD、S-2288及Chromozym p系上海东风试剂公司产品，其他试剂均为化学纯或分析纯级。

1.2方法

1.2.1EFE的分离纯化：将人工养殖蚯蚓收集洗净，绞碎后置于4℃预冷的抽提液（40mmol/L，pH8.0 Tris-HCl ，含0.5mol/L NaCl）中，组织匀浆器处理后经10000×g离心10min，收集上清液迅速升温至55℃，进行选择性热变性处理1h，冷至室温后离心收集上清液，再经聚乙二醇6000浓缩成约含10%蛋白后作为上柱样品（蛋白质浓度测定参照 Bradford法^［1］）。亲和层析柱制备参照张龙翔等^［2］方法：将HD与溴化氰活化的Sepharose4B混匀，轻摇4℃过夜，使其偶联整合，装入1.5cm×15cm柱中，用50mmol/L，pH8.0 tris-HCl（含0.5mol/L NaCl）缓冲液平衡，流速48ml/h。取样品上柱，双蒸水洗脱，流速为30ml/h。洗脱活力峰浓缩，再经DEAE-Sepharose柱进一步纯化，以0～0.5mol/L NaCl梯度洗脱。

1.2.2纤溶酶（酰胺）水解活力测定：参照邵承斌等^［3］方法，采用合成底物S-2288（HD-ile-Pro-Arg-PNA)和Chromozym p(cb2-Gly-Pro-Arg-PNA)，反应体系为：50μl适当稀释的样品，2.2ml50mmol/L， pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，250μl S-2288或Chromozym P贮备液（0.2mg/ml）。25℃条件下用1cm光径比色皿，在λ405nm下记录PNA的释放速率，其摩尔消光系数Δε以1×10⁴（mol/L×cm）^-1计算；1个酰胺水解活力单位（U）定义为酶作用下每分钟水解产生的PNA数为1nmol。

1.2.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：参照文献［4］进行。

2结果

2.1EFE分离纯化结果HD-Sepharose4B亲和层析图谱见图1，DEAE-Sepharose 进一步纯化图谱见图2；其中峰Ⅲ具有水解合成底物S-2288和Chromozym p的活性。可用Arg-Sepharose 4B将峰Ⅲ分为二部分，先洗脱部分含两种蛋白（合称F₁、₂），后分离部分含一种蛋白（F₃）。后者量虽少但活性高（见图3），经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实F₃是一种成分均一的蛋白组分。

图1HD-Sepharose 4B亲和层析

图2EFE的DEAE-Sepharos层析

图3EFE的精氨酸Sepharose4B

2.2EFE的热稳定性55℃选择性热变性1小时，其比活力从24.60KU/mg下降至23.47KU/mg，仅损失4.6%，可见其热稳定性强。

2.3合成底物S-2288和Chromozym P对EFE 的敏感性参照邵承斌等^［3］方法，改变底物浓度，测定EFE-F₃的酰胺水解速率的变化，通过双倒数作图，计算两合成底物的Km，Km值分别是0.01mmol/L和0.02mmol/L（见图4）。

2.4HD对EFE-F₃催化活性的抑制作用通过HD对EFE-F₃作用于合成底物双倒数作图影响的分析，发现HD对这两种底物均表现为竞争性抑制，其Ki都为1mmol/L（见图5）。

图4EFE-F₃对酰胺水解活性的双倒数图

图5HD-对EFE-F₃的抑制效应

2.5EFE对脲的抗性EFE-F₃ 经4mol/L脲处理1小时，再测其酰胺水解活性，发现其比活性从35.70KU/mg下降到33.60KU/mg，活性仅损失5.8%，可见该酶能抗蛋白变性剂脲的处理。3讨论

3.1HD对两种底物的Ki均为1mmol/L，其抑制效率不仅远高于精氨酸^［3］，且仅仅针对纤溶酶中具有水解S-2288和Chromoym p的活性成分进行亲和层析，表明HD-Sepharose对纤溶酶具有很强的生物特性。这一特性将为EFE的纯化提供一种相当理想的方法。

3.2EFE具有酰胺水解活性的组分在蛋白质含量上相对较低，但敏感性研究表明其Km值在10^-2mmol/L数量级水平。这不仅在酶学理论上，在实际应用上也具有很重要的意义，有望发展成为一种崭新的溶栓药物^［5］。

3.3EFE的稳定性实验中，提示EFE对热稳定性强，能抗蛋白变性剂脲的处理，而金属离子对其的影响有待进一步探讨。

基金项目：温州医学院科技发展基金资助项目(XN980022)

作者简介：毛孙忠（1970-），男，浙江玉环人，讲师。

毛孙忠(温州医学院 生化教研室，浙江 温州325027)

严哲(温州医学院 生化教研室，浙江 温州325027)

陈石根(复旦大学 生化系，上海200437)

参考文献

［1］张龙翔，张庭芳，李念媛.生化实验方法和技术［M］.北京：高等教育出版社，1981.206-209.

［2］Bradford MM. A rapid and sensetitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］. anal Biochem，1976，72：248-254.

［3］邵承斌，杨继虞，徐敏华,等.一种测定蚯蚓纤溶酶活力的简易方法［J］.中国生化药物杂志，1997，18 (6)：301-304.

［4］Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T₄［J］. Nature，1970，227：680-683.

［5］赵晓喻，静天玉.蚯蚓纤溶酶的成分分析［J］.中国生物化学与分子生物学报，1998，14(4)：407-411.