中华创伤杂志2000年第16卷第7期

冯海龙高立达黄光富谭海斌廖晓灵陈勇

摘要目的探讨大鼠创伤性脑损伤后一氧化氮／诱生型一氧化氮合酶(NO／iNOS)神经细胞毒性作用机制。方法将雄性SD大鼠150只随机分为假手术组、重型脑伤对照组、左旋精氨酸(L-Arg)治疗组、伤后6 h iNOS抑制剂氨基胍(AG)治疗组、伤后12 h AG治疗组。采用同位素标记法和免疫组化双酶双标技术，研究大鼠重型脑伤后iNOS活性变化及其细胞定位；观察iNOS抑制剂氨基胍(AG)及其作用底物L-Arg对大鼠重型脑伤后神经损害程度、学习和记忆力的影响；并采用末端标记法(TUNEL)和琼脂糖电泳，观察AG和L-Arg对大鼠不同脑域神经细胞死亡(包括细胞坏死和细胞凋亡)动态变化过程的影响。结果重型脑伤后12 h iNOS活性增高，高峰时间1～3 d，持续达1周。AG具有明确的脑保护功能，可明显减轻创伤后神经废损的程度，改善学习和记忆功能。L-Arg加重脑继发损害。NO／iNOS导致神经细胞死亡包括坏死和凋亡两种形式。神经细胞死亡机制不同可能与NO／iNOS作用强度及不同部位易损性差异有关。iNOS表达具有细胞多源性，其中星形细胞具有重要作用。结论NO／iNOS参与外伤后脑的继发损害及迟发性神经细胞死亡。

关键词：一氧化氮；酶类，一氧化氮；脑损伤；细胞凋亡，神经元

目前有关诱生型一氧化氮合酶(inducible nOS, iNOS)活化表达与脑外伤后迟发性神经细胞死亡的关系尚未阐明。笔者采用特异性iNOS抑制剂氨基胍(aminoguanidine,AG)对脑外伤后NO/iNOS神经细胞毒性作用的机制进行探讨，试图阐明脑外伤后NO/iNOS迟发性神经细胞毒性作用与创伤性神经细胞凋亡之间的关系。

材料与方法

1. 实验分组及重型脑伤模型制作:雄性SD大鼠150只，体重250～300 g。随机分为6组：(1)假手术组；(2)重型脑伤对照组；(3)左旋精氨酸治疗组(L-Arg)(1200 mg/kg腹腔注射)；(4)伤后6 h AG治疗组(200 mg/kg腹腔注射)；(5)伤后12 h AG治疗组(同等剂量)。伤后连续给药3 d。重型脑伤组及假手术组以等渗盐水腹腔注射作为对照。

采用Shapira等^［1］重物坠落致伤方法制作大鼠左顶重型颅脑损伤模型。大鼠麻醉后，左顶头皮切开，于人字缝及冠状缝中份，中线旁3 mm颅骨处黏附固定直径5 mm，厚度1 mm钢片，致伤物重1 600 g，直径5 mm，重型脑伤致伤高度7 cm。大鼠伤后6，12，24，48，72 h及1，2周脱颈椎处死，经心脏灌注质量浓度为40 g/L的磷酸甲醛，取脑组织脱水固定送检。

2. 神经功能监测：采用神经损害程度量表(neurological severity score，NSS)^［2］对大鼠伤后1周神经功能进行评定。

3. Morris 水迷宫法(morris water maze，MWM)^［3］测定：采用MWM测试大鼠伤后2周的学习功能和空间记忆力。

4. iNOS活性测定：参照Iadecola等^［4］方法，采用同位素［³H］-L-Arg标计法测定大鼠伤后12 h～2周伤灶同侧脑组织iNOS酶活性变化。对侧脑组织同法处理对照。

5. 免疫组织化学检测：iNOS细胞定位采用双酶双标法进行。iNOS(Ⅰ抗)、DBA(显色剂Ⅰ)、GFAP(Ⅱ抗)、AEC(显色剂Ⅱ)依次作用。iNOS和GFAP同时表达的细胞镜下呈褐色。

6.末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)染色：采用Gavrieli等^［5］方法，对大鼠伤后6 h～2周伤灶中心60°范围内皮质及海马神经细胞行TUNEL检测，对侧脑组织同法处理作为对照。按德国BM公司(in situ cell death detection kit, AP)说明书操作。

7. 琼脂糖凝脉电泳：采用BM公司凋亡电泳检测试剂盒(apoptotic dNA ladder kit)对大鼠伤后72 h海马组织凋亡泳带进行检测。

8. 统计分析：采用单因素方差分析，SNK方法两两比较。

结果

1.神经损害程度评价：重型脑伤后NSS评分结果显示，L-Arg治疗组神经损害程度(15.0±0.1)明显加重（重伤对照组为8.7±0.8，P＜0.01）;伤后6 h AG治疗组NSS评分(6.3±0.4)较重伤组低(P＜0.05)，伤后12 h AG治疗组NSS评分(8.9±0.1)与重伤组差异无显著性意义(P＞0.05)。

2. MWM测试结果：MWM检测结果显示，L-Arg加重脑外伤后大鼠学习和记忆功能障碍［L-Arg组学习和记忆时间分别为(56.8±4.7) s、(48.3±2.1) s；重伤对照组为(39.2±2.7) s、(23.5±5.2) s, P＜0.05］；伤后6 h内AG治疗能明显改善大鼠学习和记忆能力［(15.7±4.8) s、(10.5±3.6) s, P＜0.05］；伤后12 h给予AG治疗，大鼠学习和记忆功能无明显改善［(36.5±3.3) s、(21.4±2.7) s, P＞0.05］。

3. 重型脑外伤后iNOS活性变化：重型脑外伤后iNOS活性明显升高。伤后12 h，iNOS活性即出现增高现象，伤后1～3 d，iNOS活性达到高峰，持续时间长达1周，伤后2周iNOS活性降至对照组水平。见图1。

图1重型脑伤后iNOS活性变化

4. iNOS免疫组织化学检测及细胞定位：免疫组织化学检测结果表明，创伤灶周边区域、海马、齿状回、胼胝体、桥脑、丘脑及周围血管区存在iNOS阳性染色细胞。双酶双标检测显示部分iNOS阳性染色细胞同时呈GFAP阳性染色，此类细胞主要集中在创伤灶周边区域及海马。部分细胞仅呈iNOS阳性染色，而GFAP为阴性染色,散在分布于脑实质和血管周边。

5. AG、L-Arg对创伤性神经细胞死亡的影响：笔者发现脑外伤后存在两种类型TUNEL阳性染色的神经细胞。Ⅰ型TUNEL细胞表现为胞浆红染，核着色轻，结构疏松，细胞肿胀明显，细胞质无浓缩现象，胞核无固缩。超微结构显示细胞不完整，胞膜破裂，线粒体肿胀破坏，细胞核溶解，符合坏死细胞特点。Ⅱ型TUNEL细胞表现为圆形、皱缩的形态特点，核固缩、不规则，整个细胞着色深，细胞核红染明显。超微结构显示核固缩，染色质边聚，线粒体大致完整，符合凋亡神经细胞特点(图2)。

伤灶中心皮层神经细胞主要表现为坏死，L-Arg组伤后12 h～1周皮层TUNEL阳性细胞计数均明显高于重伤对照组；伤后6 h内给予AG治疗能明显降低伤灶皮层神经细胞死亡。AG主要降低重伤组TUNELⅠ型细胞数目，而TUNELⅡ型细胞计数结果与对照组并无明显区别(P＞0.05)；伤后12 h 给予AG治疗无明显效果。

海马神经细胞死亡主要表现为神经细胞凋亡，L-Arg组伤后12～72 h海马TUNEL Ⅱ型细胞计数均高于重伤对照组(P＜0.05)；伤后6 h内给予AG能明显降低海马TUNELⅡ型细胞数量，伤后12 h～1周与重伤对照组均有统计学意义(P＜0.05)；伤后 12 h 给予AG对海马神经细胞死亡无明显影响。

图2重型脑外伤后神经细胞TUNEL染色和透射电镜观察结果。A.Ⅰ型TUNEL细胞形态学改变×400；B.Ⅰ型TUNEL细胞超微结构变化×10000；C.Ⅱ型TUNEL细胞形态学改变×400；D.Ⅱ型TUNEL细胞超微结构变化×8000

琼脂糖电泳结果显示，L-Arg治疗组及12 h AG治疗组海马脑组织电泳仍然存在凋亡特征性梯状条带，伤后6 h内给予AG治疗组脑组织电泳未发现凋亡带谱。

讨论

近年来研究显示，iNOS活化表达具有特异性、迟发性及NO高产出性等特点，其在脑伤后脑继发损害及神经细胞迟发性死亡中的作用引起了众多学者的高度重视。笔者采用同位素酶活性检测技术发现，脑外伤后iNOS活性明显升高，峰值时间出现较早，且持续时间长。iNOS特异性抑制剂AG能明显减轻脑外伤后的神经功能损害程度(NSS)及学习和空间记忆力障碍，NOS底物L-Arg则有加重神经损害的作用。研究表明，脑外伤后NO／iNOS表达与脑外伤后神经细胞毒性作用密切相关，iNOS抑制剂具有明确的神经保护作用。

有研究表明，脑外伤后星形细胞参与了iNOS的活化表达。星形细胞是产生NO的主要细胞，脑损伤后IL-1β可直接刺激星形胶质细胞表达iNOS并产生大量的NO，造成神经细胞损害，实验中同时发现，脑伤后iNOS活化表达具有细胞多源性^［6］。

本实验中TUNEL染色、琼脂糖凝脉电泳、电镜及光镜检测结果证实，NO / iNOS在脑伤后不同部位所引起的细胞死亡形式（包括细胞坏死和细胞凋亡两种形式）有所不同。伤灶皮层区域以神经细胞坏死为主；远离伤灶的海马则主要表现为神经细胞凋亡。细胞死亡机制的差异可能与致伤程度及受损部位的易损性差异有关^［7］。创伤灶中心打击力强大，跨膜离子转运机制紊乱，NO、氧自由基、兴奋性氨基酸及Ca²⁺超载等作用导致细胞能量代谢和呼吸功能衰竭^［8］，细胞肿胀坏死。创伤灶周边区域，即所谓半影区，细胞处于静息垂死状态，内环境改变较缓慢，凋亡调节基因启动，最终导致细胞凋亡。NO/iNOS引起细胞凋亡的机制尚不明确。Liu等^［9］研究发现，NO可以抑制细胞DNA合成，反应产物亚硝酸根离子(ONOO^-)可使DNA烷化，并抑制DNA修复<