中华创伤杂志2000年第16卷第6期

顾小曼付小兵杨银辉孙同柱蒋礼先

摘要目的研究烧伤后皮肤两种原癌基因(c-fos、c-myc)与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)基因、蛋白的表达特征，探讨3种基因的调控关系，并以增殖细胞核抗原（PCNA）胶原纤维含量的变化评价它们对组织修复的影响。方法建立深Ⅱ度烫伤大鼠模型，采用原位杂交、RT－PCR、免疫组化及V.G特染检测皮肤组织生长相关因子基因和蛋白表达水平的变化。结果烧伤皮肤组织中上述生长相关因子基因或蛋白的表达呈现一定的规律性，c-fos、c-myc及bFGF基因在早期活跃细胞增殖阶段分别有不同程度的表达，在稍后的创伤愈合阶段则表达降低，而胶原纤维和PCNA的含量则在修复愈合阶段开始上升。结论在组织修复过程中，c-fos、c-myc和bFGF3种生长相关因子的基因表达存在相互的网络调控作用，并由此影响修复细胞的增殖与分化。在后期的愈合阶段，3种因子表达明显受抑制，可能与胶原的沉积有关。

关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；原癌基因；增殖细胞核抗原；胶原；创伤愈合

已有许多体内研究表明，组织损伤后的再生过程是由损伤区局部的一些生长因子及其受体来调控的^［1］。这些具有促有丝分裂功能的生长因子在伤区的表达可能与体内组织再生过程中复杂的网络调控机制有关。笔者探讨原癌基因与生长因子之间的相互调控关系，以及这种调控作用对创面修复的影响。

材料与方法

1. 动物模型：雄性Wistar大鼠40只，体重250～300 g，随机分为7组，以质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.15 ml/100 g）。致伤组置于98℃水中8 s，造成30％ TBSA烫伤创面，经组织学证实为深Ⅱ度烫伤。伤后按每100 g体重腹腔注射等渗盐水4 ml行休克期复苏，于伤后3，6 h 及1，3， 7， 14 d各取6只大鼠的创面组织和2只大鼠的正常皮肤，分别置于体积分数为4%的甲醛和质量浓度为40 g/L的多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋，切片5 μm备用。同时取新鲜标本置于液氮中保存备用。

2．c-fos、c-myc和bFGF蛋白的免疫组化检测：c-fos与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白的检测使用石蜡切片，而c-myc使用冰冻切片，操作步骤参考SP kit说明书（中山试剂公司）。一抗购自美国San Cruz公司。复染后常规脱水、透明、封片，显微镜下观察，同时设无一抗的空白对照。阳性染色颗粒为棕黄色。

3．c-fos、c-myc和bFGF mRNA的原位杂交检测：地高辛（DIG）标记的c-fos、c-myc和bFGF cDNA探针购自北京医科大学肿瘤研究所，其余显色试剂使用地高辛标记试剂盒（B.M.公司，德国）。石蜡切片、常规脱蜡、梯度乙醇脱水后，预处理玻片。脱水晾干后放入预杂交液中孵育2 h，然后将含有探针的杂交液（探针浓度2 μg/ml）滴至玻片上，42℃湿盒杂交20 h。充分漂洗后用Anti－DIG－AP孵育2 h,NBT/BCIP显色过夜，反应终止后常规脱水、透明、封片，同时设无探针的空白对照。阳性染色颗粒为蓝色。

4． 3种生长相关因子基因的逆转录PCR检测：取液氮冻存组织，用RNA提取试剂盒（GIBCO-BRC,Trizol reagent,美国)提取组织中总RNA，经紫外分光光度计定量。每个标本取2μg总RNA进行反转录。取4 μl反转录产物加入50 μl PCR体系中，1 u Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。bFGF的引物序列为： 上游5-GGC-TTC-TTC-CTG-CGC-ATC-CA-3′下游5′-GCT-CTT-AGC-AGA-CAT-TGG-AAG-A-3′；c-myc的引物序列为：上游5′-TCT-TCT-TCC-TCG-GAC-TCG-CT-3′下游5′-GGT-GTC-GTT-TGG-AGG-TGT-GT-3′；c-fos的引物序列为：上游5′-GTT-CTC-GGG-TTT-CAA-CGC-GGA-CTA-CGA-GGC-3'下游5'-GGC-ACT-AGA-GAC-GGA-CAG-ATC-TGC-GCA-AAA-GTC-C-3'。 c-myc、c-fos和bFGF的扩增条件分别为：94℃1 min,56℃ 1 min,72℃ 1 min,32个循环；94℃ 40 s,60℃ 40 s,35个循环；94℃1 min, 50℃ 1 min,72℃ 1 min,38个循环。然后在72℃延伸10 min，取10μl PCR产物在质量浓度为20 g/L的琼脂糖凝胶电泳上观察。

5． 修复结局的评价：使用增殖细胞核抗原（PCNA）和胶原特染评价创伤后不同时相组织修复的效果。PCNA使用免疫组化技术，方法同上；胶原纤维使用V.G特染。

6．统计学处理：实验结果分别在镜下进行电脑图像分析，实验数据以±s表示，并作t检验。

结果

1. 烫伤创面 bFGF 、c-fos和c-myc mRNA的表达：(1) bFGF mRNA。正常皮肤含有丰富bFGF mRNA，主要位于真皮深层。烫伤后3 h其表达消失，伤后1 d 开始出现，7 d时消失，至伤后14 d基本恢复至伤前水平（图1）。(2) c-fos/c-myc mRNA。正常皮肤组织含有微量c-fos mRNA，分布部位同bFGF mRNA。烫伤后3 h c-fos mRNA开始增加，伤后6 h达高峰，伤后1 d消失，至伤后14 d 基本恢复至伤前水平。c-myc mRNA的表达同c-fos类似，但其表达的高峰出现在伤后3 d（图2）。

2. 烫伤创面c-fos、c-myc和bFGF蛋白的表达：免疫组化结果显示，所有创面中皆有c-fos蛋白表达，但其表达的出现时间在伤后3 h,主要位于真皮层毛细血管内皮细胞和成纤维细胞的胞核中。c-myc蛋白在正常皮肤含量甚微，但在致伤后1 d可以检测到c-myc阳性信号，伤后3 d达高峰。切片中可见大量阳性颗粒，主要位于真皮层间质细胞的胞桨中。而bFGF的表达在致伤后6 h阳性信号较多，主要分布于表皮基底细胞、真皮成纤维细胞和血管内皮细胞，伤后1 d达高峰，仅次于在正常皮肤组织中的表达。

与正常对照组比较：^*P＜0.05^**P＜0.01

图1创面愈合过程中bFGF mRNA的表达

与正常对照组比较：^*P＜0.05^**P＜0.01

图2创面愈合过程中c-fos和c-mgc mRNA的表达

3. 修复结局的评价：(1) pCNA的表达： 在400倍视野下计数PCNA阳性细胞数，每一标本选取6张切片，每一切片分别选取表皮及真皮浅层和真皮深层两个视野，计数PCNA阳性细胞数（图3）。正常皮肤PCNA阳性信号主要来自基底细胞及毛囊细胞的胞核中，这些旺盛的PCNA阳性细胞排列规则。深Ⅱ度烧伤后表皮细胞坏死，表皮及真皮浅层细胞变性，失去分裂增殖能力，但此时真皮深层细胞增殖活性也下降，一直到伤后3 h才有所恢复；至伤后7 d，真皮深层毛囊细胞出现增殖分裂能力，部分演化为上皮细胞，且真皮深层成纤维细胞及部分炎症细胞也出现较多PCNA阳性表达；至伤后14 d，PCNA表达有所下降，新生表皮部分覆盖创面，此时PCNA的表达主要位于基底细胞层，但排列不规则，真皮层的阳性信号减少，基本恢复至伤前水平。(2)胶原蛋白的表达：V．G特染结果显示，伤后早期创面胶原量减少，低于正常皮肤，于伤后3 d 降至最低，7 d时又逐渐增加，至伤后14 h基本恢复至伤前水平（图4）。

与正常对照组比较：^*P＜0.05^**P＜0.01

图3伤后皮肤创面PCNA的表达

与正常对照组比较：^*P＜0.05^**P＜0.01

图4创面胶原基质变化

讨论

正常组织修复的特征是修复细胞处于活跃的增殖状态，这种增殖状态与创面局部一些促进组织再生的生长因子和受体表达的直接刺激和对修复细胞的调控有关，如表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子（PDGF）和转化生长因子β(TGF-β)等。在急性细胞增殖期，它们的表达会有不同程度的增加或降低。另外，bFGF及其受体也有相似的作用^［2］。现已证明，许多生长因子如EGF、TGF、PDGF和bFGF，以及近来的角化细胞生长因子（KGF）等在创伤修复中均具有重要作用^［3］。但是关于特定内源性生长因子的活性及其在创面愈合中定位和表达的时相特征研究较少。虽然应用外源性生长因子可以加速创伤愈合，但并不表明创面的生长因子蛋白是否缺乏。因此，阐明在烧(创)伤条件下组织内源性生长因子基因及蛋白的表达特征及其网络调控关系，并针对这些特征特异性补充所缺乏的生长因子对创面愈合具有重要意义^［4］。

bFGF作为一种“创伤激素”，具有广泛的生物活性^［5］。它可以促进有丝分裂，趋化炎性细胞，并促进毛细血管胚芽形成。笔者发现，在伤后急性细胞增殖期，3种因子及其蛋白具有不同程度的诱导作用，而在创面愈合期该作用又受到抑制。c-fos、bFGF和c-myc的表达分别在伤后3 h、1 和3 d达到高峰，其表达时相均在受损组织再上