中国矫形外科杂志2000年第7卷第10期

许鹏蔡乾坤（综述）郭雄（审校）

关键词：氧自由基；软骨

关节软骨是构成可动关节的重要结构，多种骨关节疾病都不同程度的存在有关节软骨损伤，尤其是类风湿关节炎和骨关节病。关节软骨自身修复能力很差，损伤后往往很难自愈，可引起长期的疼痛及关节功能障碍，给人们生活带来极大的痛苦和不便。由于骨关节疾病中软骨损伤的分子机理，尚未完全清楚，使得治疗和预防这些疾病比较困难。最近有研究表明，减低关节内氧自由基的水平，可减轻关节软骨的损伤。本文就氧自由基与软骨代谢的相关研究进展进行了综述。

1氧自由基的反应活性

自由基又称游离基，就是具有未配对电子(即外层轨道中具有奇数电子)的原子、原子团、离子或分子。自由基反应的最大特点是化学活性很强，反应常呈连锁性，但寿命极短。自由基代谢中与人类关系最密切的是活性氧(reactive oxygen species,ROS)的代谢。氧是人类赖以生存的物质，但氧形成的某些形式又具有毒性。正常情况下，98%的氧接受4个电子与H^＋结合还原成水，但也有1%～2%采取单价还原形式产生ROS。ROS就是由氧形成的几种活性物质的总称，主要是超氧阴离子自由基(O₂^－)、羟基自由基(OH^·)、过氧化氢(H₂O₂)单线态氧(^·O₂)4种，前二者为自由基，称氧自由基。

氧自由基是具有很强反应活性的基团，生理剂量的氧自由基可参与前列腺素、凝血酶原和胶原蛋白的合成及核糖核苷的还原，并有解毒、杀菌作用；还可作用于信号转导的全过程，引起相应生物学效应；但氧自由基亦可对氨基酸、多肽及蛋白质进行化学修饰，改变其结构和功能，促使降解，使细胞膜发生脂质过氧化，成为许多疾病发生的基础。如O₂^－等活性氧主要毒性作用是损伤细胞膜和具有膜结构的内质网、溶酶体、线粒体等，使这些膜磷脂结构内的多数不饱和脂肪酸过度氧化形成脂质过氧化物(ROOH)，伴随ROOH的形成可产生丙二醛(MDA)。MDA是脂质过氧化的产物，因此测定体内MDA的含量可以反应体内氧自由基的大小以及脂质过氧化的程度。

体内存在着完善的氧自由基清除系统，一般来说，细胞可通过各种抗氧化机制进行自我保护和对抗氧化。一些酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱苷肽酶(GSH-Px)和过氧化物酶都能对抗ROS，而谷胱苷肽、半胱氨酸和维生素E和C是非酶类的抗氧化剂，可使机体免受氧化损伤。例如，SOD就是O₂^－的清除剂，属金属酶，它催化O₂^－发生下列歧化反应：O₂^－＋O₂^－＋2H^＋→H₂O₂＋O₂。根据这个基本原理，可测定体内SOD活性的大小来间接地反映体内O₂^－相对含量的高低。

2关节内氧自由基的产生

炎性关节疾病特别是类风湿性关节炎，关节滑膜、滑液、血管翳内有中性白细胞、巨噬细胞聚集，当它们表面受免疫复合物、补体成份等作用时可释放大量O₂^－和H₂O₂，两者又很容易形成活泼的OH^·。已证明在类风湿性关节炎和骨关节病关节液中氧自由基含量升高^［1］。

关节软骨有潜在的产生氧自由基的能力。有文献报道，还原型辅酶Ⅱ(NADPH)类氧化酶复合体可刺激猪关节软骨释放ROS^［2］；在人软骨细胞系C—20/A4细胞中含有NADPH类氧化酶复合体，可产生O₂^－［3］。Rathakerishnan等研究发现，可溶性刺激物如佛波醇—肉豆蔻酸—醋酸盐、刀豆素A等孵育的关节软骨细胞，可产生H₂O₂和^·O₂；在活体关节软骨组织中，包绕在基质中的软骨细胞可产生O₂^－［4］。关节软骨中亦存在有自由基清除剂。Gomes等发现在鲨鱼软骨中存在有一种抗诱变剂，可清除ROS，正常或低铁情况下能对抗ROS引起的损伤^［5］。Frederiks也发现，在正常小鼠的软骨中存在有高活性的SOD^［6］。

3氧自由基对软骨代谢的影响

软骨是一高度有机化组织，由软骨细胞和软骨基质组成。软骨细胞是软骨组织中唯一具有活性的成分，占整个软骨组织体积的1%左右。软骨细胞被其在生长过程中产生的软骨基质包绕，软骨基质由胶原和蛋白多糖聚合体构成。胶原约占软骨干重的65%，蛋白多糖约占软骨干重的30%，水约占软骨总重量的60%～80%。现已表明，氧自由基对软骨中细胞及基质的代谢均有影响。

3.1氧自由基对软骨细胞的损伤

氧自由基可抑制软骨细胞增殖，引起软骨细胞死亡。Panasiuk等对单层培养的软骨细胞研究表明：氧自由基可抑制软骨细胞的增殖，减少软骨细胞胶原的合成；氧自由基和蛋白酶一起能明显增加细胞的脱壁和细胞间基质的破坏^［7］。培养的猪关节软骨细胞中加入氧自由基，16h后细胞膜的完整性会破坏^［8］。国内亦有学者报道，氧自由基可抑制关节软骨细胞DNA合成，引起软骨细胞膜严重损伤。氧自由基还能引起培养成人和人胚关节软骨细胞DNA损伤，从而影响细胞的分裂增殖，使细胞生长异常，破裂死亡^［9.10］。氧自由基对软骨细胞的影响可能由于氧自由基特别是OH^·攻击DNA及合成DNA所需的酶，使DNA发生链的断裂，并损害碱基，影响DNA-DNA、DNA-蛋白质交联；受损的DNA转录复制功能减弱，细胞分裂繁殖障碍，严重的DNA损伤导致细胞死亡。

3.2氧自由基对软骨蛋白多糖的影响

在离体实验中，氧自由基可抑制软骨基质蛋白多糖的合成，促进基质中蛋白多糖的降解^［11］。Panasyuk等在黄嘌呤氧化酶—次黄嘌呤产生的氧自由基对单层培养兔的软骨细胞研究中发现，ROS低浓度时刺激、高浓度时抑制35SO₄和3H-葡萄糖胺掺合到蛋白多糖的合成中，高浓度的抑制作用可被SOD和CAT遏制；ROS高浓度时抑制3H-尿苷的掺合，但不影响细胞对35SO₄和3H-尿苷的摄入；ROS通过分裂核心蛋白部分和破坏透明质酸(HA)粘合区改变HA和蛋白多糖单体，改变的蛋白多糖单体不能同正常的HA相互作用形成蛋白多糖聚合体，但断裂的HA仍保持明显的蛋白多糖单体结合力，而PG-HA复合体很容易被ROS不可逆破坏^［12］。此结果表明，在生理条件下，ROS低浓度时抑制蛋白多糖合成，病理状态下ROS过度产生，可改变软骨代谢和大分子结构。国内朱杰等采用［35S］-SO₄^2－掺入及基质和培养液中葡萄糖醛酸含量测定对软骨细胞合成蛋白多糖能力进行评价，表明加入自由基后，人胚软骨细胞合成蛋白多糖的能力受到明显抑制，35S-硫酸蛋白多糖放射性活度及葡萄糖醛酸含量比对照组明显减低(P〈0.01)^［13］。氧自由基对蛋白多糖的影响机理如下：(1)氨基蛋白多糖的侧链是按顺序加单糖到木糖化的核心蛋白上形成共需六个不同的糖基转移酶及一个特异性磺基转移酶的相继作用，氧自由基造成这些酶和核心蛋白损伤，使硫酸蛋白多糖合成障碍。(2)核心蛋白是由粗面内质网的多聚蛋白体合成，氨基多糖链的延长和硫化开始在粗面内质网，而后于高尔基体中进行。脂质过氧化作用造成的粗面内质网、核蛋白体的损害破坏了蛋白多糖合成的场所，从而影响了蛋白多糖的合成。氧自由基还可作用于蛋白多糖中的HA。黄嘌呤氧化酶—次黄嘌呤产生的氧自由基对高透明质酸和低透明质酸有解聚的作用；氧自由基处理的猪培养关节软骨细胞核苷三磷酸迅速减少，一过性出现焦磷酸，磷酸单酯和双磷酸二酯的浓度增加，并且核苷三磷酸减少和双磷酸二酯增加与氧自由基的量相关^［8］。此外，OH^·能引起软骨多糖中糖苷键裂开，形成甲酸盐^［14］。

3.3氧自由基对软骨胶原代谢的影响

通过测定培养人胚软骨细胞基质羟脯氨酸含量再换算成胶原含量来观察受氧自由基作用的软骨细胞合成胶原能力，有人表明氧自由基明显抑制人胚软骨细胞胶原的合成^［13］。氧自由基对软骨细胞胶原的合成影响由氧自由基作用于转录、翻译、羟化等多个环节对DNA及合成胶原所需酶损伤和氧自由基引起脂质过氧化作用对胶原合成的场所内质网损害引起。Bukhardt实验发现次黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶产生的氧自由基可使软骨块孵育液中羟脯氨酸含量明显升高，这表明氧自由基可降解软骨胶原^［11］。Shingu等报道，氧自由基参与了软骨基质降解，并调节了软骨细胞胶原酶的激活，IL-6、SOD、CAT等可抑制软骨细胞过氧化物的产生，而抑制软骨基质的降解^［15］。可见氧自由基对胶原降解的影响与其对胶原酶的激活有关。体外实验还表明，软骨细胞在自由基作用下，合成和分泌蛋白多糖和胶原的功能明显改变，表现为蛋白多糖合成受到抑制，胶原的分泌由Ⅱ型转变为Ⅰ型，引起软骨细胞退变。

4氧自由基对软骨代谢影响的临床意义

许多炎性关节疾病如类风湿性关节炎和骨关节病关节软骨损伤的发生机理至今尚未完全清楚。研究表明，在类风湿性关节炎和骨关节病患者和模型动物血清和关节液中氧自由基水平升高，氧自由基清除剂SOD、CAT、GSH-Px和过氧化物酶等活性降低，脂质过氧化产物增加；高水平的氧自由基主要来源于免疫和炎症