军事医学科学院院刊2000年第24卷第3期

邢桂春张津辉魏汉东陈惠鹏柳晓兰邱丽玲贺福初

摘要目的：人血小板生成素(TPO)在大肠杆菌中的高效表达。方法：利用PCR技术，扩增出了（1～174个氨基酸的）人血小板生成素cDNA，并将其克隆到pGEX-1λT载体中，构建了融合蛋白表达质粒。重组子用限制性内切酶酶切鉴定，表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果：限制性内切酶酶切鉴定表明重组子含有正确的（1～174氨基酸)TPO cDNA片段；表达产物经SDS-PAGE相对分子质量约为43 000，与预期的相符合，表达占可溶性菌体总蛋白的44.56%。结论：表达产物具有明显的刺激Mo7e细胞增殖与CFU-Meg生成的功能。

关键词：血小板生成素；聚合酶链反应；cDNA克隆；融合蛋白；基因表达；大肠杆菌；电泳，聚丙酰凝胶

人血小板生成素(human thrombopoietin, hTPO) 是血液学界寻找已久，但只是在1994年才被克隆成功的造血调控因子。由于它具有特异刺激巨核细胞-血小板生成的作用，人们普遍预期它对于治疗各种原因引起的血小板减少症会有显著效果，可能是继G-CSF、EPO之后的又一重要药物。

我们已成功地用反转录PCR法从中国人胎肝mRNA中扩增并克隆出人血小板生成素全长cDNA^［1］，并完成序列分析。此cDNA在COS-7和CHO细胞中均能表达出典型的特异刺激CFU-Meg（骨髓巨核细胞集落）的TPO活性，但哺乳动物细胞生产TPO存在成本高、工艺难、价格贵等缺点。而Bartley等^［2］报道，1～174氨基酸的hTPO在体外具有完整生物活性，因此，我们又构建了N端非糖基化hTPO cDNA重组表达载体^［3］，表达实验未见明显的表达蛋白带，但活性测试表明，它具有能刺激CFU-Meg形成的活性。为此，我们将其重组到高效表达的融合表达载体中，以期实现其在大肠杆菌中的高效表达。

1材料与方法

1.1细菌菌株与质粒

大肠杆菌JM109、HB101、DH5α、MM294为本室保存，质粒pcDNA3-TPO带有TPO全长cDNA，为本室自行构建；质粒pGEX-1λT购自Pharmacia公司。

1.2工具酶和试剂

DNA限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ，T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶及PCR产物纯化试剂盒等分别购自华美生物制品公司和Promega公司。

1.3寡核苷酸引物的合成

所用引物均由本室自行合成，DNA自动合成仪（381A）及其成套试剂为ABI公司产品，用固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸片段。

1.4hTPO¹⁷⁴ cDNA的PCR扩增

PCR上游引物为：5′CGGAATTC ATG AGC CCT GCT CCT CCTG 3′, 含EcoRⅠ位点；下游引物序列为：5′CGGAATTC tTA GAG CTC GTT CAG TGT GA 3′，也含EcoRⅠ位点。PCR模板为pcDNA3-TPO30，在PE480扩增仪上扩增，参数为：94℃ 1 min,50℃ 1 min,72℃ 1 min 30 s，循环35次后，72℃ 7 min。

1.5融合蛋白质粒的构建

经EcoRⅠ酶切，碱性磷酸酶磷酸化的pGEX-1λT 载体和用EcoRⅠ酶切的hTPO(1～174氨基酸)cDNA，按1∶3摩尔比连接，以常规氯化钙法转入感受态E.coli jM109细胞中。

1.6hTPO¹⁷⁴ cDNA重组子酶切鉴定

以常规快速小量质粒提取法提取重组质粒,经质粒大小比较后,再用EcoRⅠ、BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组片段大小及插入方向。

1.7重组hTPO¹⁷⁴ cDNA的诱导表达

单菌落接种LB(含氨苄西林 100 μg/ml)培养基中，37℃振荡培养过夜，以1%或10%扩种后，继续振荡培养1～4 h，等其生长至D₆₀₀=0.2～1.0时，加入IPTG(终浓度0.1～1 mmol/L)，于不同时间取菌液187.5 μl，4℃收集表达菌体，表达菌体在样品缓冲液中直接裂解，进行SDS-PAGE^［4］，考马斯亮蓝R-250染色，表达产物在菌体总蛋白中所占比例由光密度(波长560 nm)薄层扫描结果确定。表达菌体收集后，用50 mmol/L Tris*Cl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA悬浮菌体，超声波破碎后，观察表达带是在上清中还是在包涵体中。

1.8重组融合蛋白的快速纯化及复性

工程菌菌体超声破碎后离心收集包涵体，依次用含1%Triton x-100及4 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris*Cl-1 mmol/L EDTA(pH8.0)洗涤，然后用SDS-PAGE样品处理液裂解，进行制备电泳，电泳后将凝胶在脱色液中固定，切下相应条带，捣碎，用电极缓冲液抽提出蛋白质^［5］，稀释至蛋白浓度为100μg/ml，对含0.1 mmol/L GSH及0.1 mmol/L GSSG(上海丽珠东风生物技术有限公司生产)的乙酸铵缓冲液(pH7.0)充分透析。

1.9活性测定

分别用Mo7e细胞以MTS法及小鼠骨髓巨核细胞集落（CFU-Meg）法测定^［6］。

2结果与讨论

2.1hTPO¹⁷⁴ cDNA的PCR扩增

以20ng pcDNA3-TPO 30重组质粒为模板，经PCR 35个循环后，取10μl样品电泳即可见强扩增带，其相对分子质量位于657 bp与454 bp之间，与其预期大小543 bp一致（图1）。

图1hTPO¹⁷⁴ cDNA的PCR产物电泳分析

1,2.PCR产物；3.pGEM-7Zf⁽⁺⁾-HaeⅢ

2.2hTPO¹⁷⁴ cDNA融合表达质粒的构建

hTPO¹⁷⁴ cDNA片段克隆到pGEX-1λT表达载体见图2所示。

2.3重组hTPO¹⁷⁴cDNA的酶切鉴定

在重组实验中，获得Ap^r菌落6个，经比较质粒大小得到6个候选克隆，为鉴定hTPO¹⁷⁴cDNA插入有无错误和重组片段是否完全，进行重组位点EcoRⅠ酶切后的电泳鉴定。结果表明，在6个候选克隆提取的质粒中除切下4.9 kb左右的载体片段外，还有一543 bp左右的插入片段（图3a），它与PCR产物以及所拟克隆的hTPO¹⁷⁴ cDNA长度一致。此结果表明插入片段内无EcoRⅠ酶切位点，从而与文献中hTPO¹⁷⁴ cDNA序列预期的一致；一方面提示所克隆的hTPO¹⁷⁴ cDNA完整。将此重组质粒命名为pGEX-TPO。由于hTPO¹⁷⁴cDNA两端只有EcoRⅠ酶切位点，为鉴定插入方向，我们用BamHⅠ对pGEX-TPO进行了酶切鉴定(图3b)，结果有4个为正向插入（即切下了一400 bp左右的外源片段)，1个为反向插入（即切下一200 bp左右的外源片段）。

图2pGEX-GST/TPO融合蛋白表达质粒的构建路线

2.4融合蛋白的表达

IPTG诱导表达的结果(图4)表明，JM109菌(pGEX-TPO)经振荡培养后能高效表达hTPO融合蛋白，表达菌体SDS-PAGE结果显示出特异的表达产物带，相对分子质量43000，光密度薄层扫描结果表明其占菌体可溶性总蛋白44.56%左右。以不同大肠杆菌(JM109、HB101、MM294、DH5α）为受体菌，其表达水平无明显差异，JM109稍高（图5）。此外，以JM109为受体菌，观察了细菌生长状态，及IPTG的浓度和诱导时间对表达水平的影响（图略）。结果表明细菌生长状态对表达水平无显著影响，以D₆₀₀=0.3～0.4稍好，诱导时间则以3～5 h最佳，诱导时间即使再延长，表达水平亦未见增加。扩种量为1%时的表达量稍高于10%的扩种量。诱导表达菌体超声破碎后，上清及沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果表明特异表达产物绝大部分以不溶性包涵体形式存在（图6）。

图3pGEX-TPO限制性内切酶酶切的琼脂糖凝胶电泳分析图谱

a:1.PCR 标志物;b:1.PCR 标志物;

2.pGEX-1λT-EcoRⅠ;2.pGEX-1λT-BamHⅠ;

3～8.pGEX-TPO(1-6)-EcoRⅠ3～8.pGEX-TPO(1-6)-BamHⅠ

图4含pGEX-GST-TPO大肠杆菌（JM109）诱导表达后

1.蛋白质分子量标准；

2～4.pGEX-GST/TPO融合蛋白表达菌体；

5～7.单独GST表达菌体；2，5.10%扩种1 h后诱导；

3，6.10%扩种3 h后诱导；4，7.1%扩种3 h后诱导

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