中国医科大学学报2000年第29卷第3期

沈静汤浩章晓芳张合张铁民

摘要目的：观察诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）在正常豚鼠耳蜗内的分布。方法：以特异性iNOS抗体，应用免疫组化ABC法结合显微图像定量分析技术，在10只正常豚鼠耳蜗冰冻切片上检测iNOS。结果：iNOS的阳性免疫反应产物分布于耳蜗的血管纹、螺旋神经节细胞、Corti器的内、外毛细胞及神经纤维。结论：正常豚鼠耳蜗有iNOS表达，提示iNOS可能参与耳蜗的生理功能。

关键词：诱生型一氧化氮合酶耳蜗豚鼠免疫组织化学

一氧化氮（nitric oxide, NO）作为新的信息物质和效应分子广泛参与机体的生理及病理过程。目前已经在外周听觉器官发现了一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）的分布^［1］, 但NO在耳蜗的作用还不十分清楚。已知NOS有三个亚型， 即神经型NOS（neuronal NOS，nNOS或NOSⅠ）、内皮型NOS（endothelium NOS，eNOS或NOSⅢ）和诱生型NOS（inducible NOS，iNOS或NOSⅡ），其中nNOS和eNOS（NOSⅠ、NOSⅢ）在生理状态下就有表达，又合称为结构型NOS（constitutive nOS，cNOS）；而iNOS正常状态下一般不表达，受炎症、紫外线及细胞因子等因素刺激后才呈诱导性表达，一经诱导其活性是其它两种亚型的一千倍，因而认为NO的神经毒及细胞毒作用可能与iNOS有密切关系。

但是新近有文献报道，生理状态下人及鼠的呼吸道上皮有iNOS的表达^［2］,对肾、骨的研究也发现相同的结果^［3，4］。是否其它组织iNOS的表达也有类似的情况，还不清楚。本研究应用兔抗鼠特异iNOS抗体、免疫组织化学ABC方法，采用冰冻切片技术，观察正常豚鼠耳蜗是否存在iNOS。

1材料与方法

1.1实验动物及耳蜗标本制作

取耳廓反射正常的健康白毛红目豚鼠10只，体重200～300 g，雌雄不拘。活杀断头，速取听泡。解剖显微镜下打开听泡，充分暴露耳蜗。刺破圆窗膜，镫骨底脱位，蜗尖钻孔，以细针缓慢注入含4%多聚甲醛的0.1 mol/L的PBS (pH=7.4), 再将标本置于该液中固定2 h。PBS液冲洗后，入10%EDTA中，4℃下脱钙5～7 d，再移入25%蔗糖磷酸缓冲液中，4℃过夜沉底。以OCT包埋标本，行20μm恒冷冰冻切片。

1.2免疫组织化学ABC法检测iNOS

采用兔抗鼠多克隆iNOS抗体（Sigma）常规ABC免疫组织化学方法染色。一抗工作浓度为1∶8000。对照染色切片以正常血清代替一抗或省去一抗，其它步骤相同。

1.3显微图像分析

用Luzex-F图像分析系统测定iNOS免疫反应阳性细胞及纤维的平均灰度值，用X±s表示。灰度值越小，表明免疫组织化学反应越强。

2结果

2.1光镜观察

经ABC法免疫组化程序的切片上，iNOS阳性反应物呈棕黄色颗粒状，对照切片上未见颗粒状阳性免疫反应产物。

经轴的耳蜗切片上，可见血管纹内缘细胞呈iNOS阳性反应，螺旋神经节细胞胞浆中也可见阳性反应颗粒，神经纤维也呈阳性反应，在Corti器的内、外毛细胞的胞浆中存在iNOS的阳性反应颗粒。

2.2iNOS阳性反应产物分布的平均灰度值测定

用图像分析系统对耳蜗切片各部位iNOS阳性免疫化学反应进行定量分析，可见血管纹内缘细胞的灰度值最低，为(90.4±1.43)，即反应强度最高；内毛细胞、外毛细胞的灰度值依次为(129.2±2.18)、(123.1±2.18)；神经纤维的平均灰度值最高，为(132.4±2.12)，阳性反应程度最低。

3讨论

iNOS最初从鼠类巨噬细胞中分离得到（1990年）。一般认为，iNOS（NOSⅡ）在正常状态下，并不存在于细胞中，只有在某些因素刺激下，才被诱导生成。一经诱导生成，酶活力持续时间长，活性高达cNOS的千倍。那么，组织细胞在正常状态下是否有iNOS的表达呢？一些研究表明，某些正常组织的细胞，在未受到上述诱导因素刺激的情况下，确实有一定程度的iNOS的表达^［2～4］。本实验证明正常豚鼠耳蜗内也存在iNOS。这种iNOS 的结构性表达越来越引起人们的重视。iNOS在正常组织表达的研究结果对iNOS只有在诱导因素刺激下才能表达的说法提出了挑战。因此，重新认识iNOS的合成过程及由iNOS 介导生成的NO的生理作用很有必要。

虽然Hess^［5］用免疫组织化学方法未在正常豚鼠、大鼠的耳蜗观察到iNOS的阳性免疫反应产物，但本实验采用冰冻切片方法的结果显示，正常豚鼠耳蜗确实存在iNOS，且依其活性强弱顺序，依次为血管纹、内毛细胞、螺旋神经节、外毛细胞和神经纤维。而对照染色切片上，未见到iNOS的阳性免疫反应颗粒。至于Hess的阴性实验结果，我们考虑可能与他们所采用的石蜡切片有关。因为在石蜡切片的制作过程中，温度升高可能会导致蛋白质变性、酶失活，这一点还有待进一步证实。

在正常豚鼠耳蜗，iNOS存在的意义可能与耳蜗的生理功能有关。我们观察到iNOS主要分布于螺旋神经节细胞和Corti器的内、外毛细胞以及血管纹，因此推测有iNOS介导生成的NO可能参与耳蜗突触间的听觉信息传递过程，并与耳蜗血流调节有关。已有实验证明，耳蜗局部灌流非选择性NOS抑制剂MTC（S-methyl-L-thiocitrulline），可使沙土鼠的耳蜗听神经复合动作电位（CAP）的反应阈提高^［6］。说明生理状态下，耳蜗的NO参与耳蜗的生理过程。那么，NO的细胞毒作用是否与iNOS有关呢？笔者认为，NO的细胞毒作用可能取决于NO的量及iNOS的活性状态，在某些病理因素刺激下，iNOS被大量诱导合成过量的NO时，就能产生细胞毒作用。对豚鼠耳蜗灌流NO供体药硝普钠（SNP），发现CAP振幅呈剂量依赖性降低，证明大量外源性NO可能对耳蜗产生毒性作用^［7］。另有文献报道，老龄小鼠其耳蜗螺旋神经节细胞（SGCs）有大量iNOS表达，且iNOS的表达伴随着SGCs的大量死亡及听觉脑干诱发反应（auditory brainstem responses,ABR）听阈增高^［8］，提示iNOS可能参与衰老过程中的听觉功能减低。

沈静（中国医科大学基础医学院听力研究室，沈阳110001)

汤浩（中国医科大学基础医学院听力研究室，沈阳 110001)

章晓芳（中国医科大学基础医学院听力研究室，沈阳 110001)

张合（中国医科大学基础医学院听力研究室，沈阳 110001)

张铁民（中国医科大学基础医学院听力研究室，沈阳 110001）

参考文献

1，Fessenden jD, Coling DE, Schacht J. Detection and characterization of nitric oxide synthase in the mammalian cochlea. Brain Res，1994, 668：9-15

2，Guo FH, De Raeve HR, Rice TW, et al. Continuous nitric oxide synthase in normal human airway epithelium in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:7809-7813

3，Morrissey JJ, Mccracken R, Kaneto H, et al. Location of an inducible nitric oxide synthase mRNA in the normal kidney. Kidney Int, 1994, 45: 998-1005

4，Hukkanen M, Hughes FJ, Buttery LDK, et al. Cytokine-stimulated expression of inducible nitric oxide synthase by mouse, rat, and human osteoblast-like cells and its functional role in osteoblast metabolic activity. Endocrinology, 1995,136: 5445-5453

5，Hess A, Bloch W, Arnhold S, et al. Nitric oxide synthase in the vestibulocochlear system of mice. Brain Res, 1998, 813: 97-102

6，Zdanski CJ, Carraso V, Johnson K, et al. Inhibition of nitric oxide synthase causes elevation of hearing threshold. Otolaryngol Head Neck Surg, 1998, 119(3):159-163

7，孔维佳，任田英， Nuttall AL. 硝普钠耳毒作用的内耳靶组织.耳鼻咽喉—头颈外科, 1996, 3(3): 176～180

8，Wu MD, Kimura M, Inafuku S, et al. Effect of aging on the expression of iNOS and cell death in the mouse cochlear spiral ganglion. Okajimas Folia Anat Jpn,1997, 74(5): 155-165