中国新药杂志1999年第8卷第10期

何军林龚雄麒

摘要目的：从结构改造上尝试延长盐酸二氢埃托啡的作用时间。方法：设计合成了盐酸二氢埃托啡与人血清白蛋白(HSA)和聚赖氨酸(PLL)的结合物(HSA与DHE·HCl的比例为1∶5,1∶8,1∶16,1∶17, PLL与DHE·HCl的比例为1∶3），并用体外透析实验测定了它们的体外水解情况，用药理实验测定了它们在小鼠身上的效价和作用时间。结果：合成了各种比例的盐酸二氢埃托啡与HSA和PLL的结合物，体外透析实验和药理实验表明这类大分子结合物的作用时间与盐酸二氢埃托啡相近，而降低了效价。结论：我们认为效价降低、作用时间相当是由于与生物大分子结合后的结合物比原药分子大得多，不利于在体内转运和穿过血脑屏障，只有在血液中被水解出小分子后才能发挥作用。

关键词：盐酸二氢埃托啡高效镇痛剂大分子结合物有机合成

盐酸二氢埃托啡是一种高效镇痛剂，效价比吗啡高得多，因为其不良反应较大，还有待进行结构改造以改善其药理性质。其中作用时间较短是它的一个不足之处，为此我们根据它的结构特点探讨了合成它与大分子形成结合物的方法来达到延长药物作用时间的目的。二氢埃托啡分子中的酚羟基是一个重要的药效基团^［1］，但是它容易由于首过效应而被破坏掉，借助它与大分子如人血清白蛋白(HSA)、聚赖氨酸(PLL)等形成结合物^［2］，以此方法来探讨延长盐酸二氢埃托啡的作用时间的可能性和不同的结合比对缓释速率、作用时间的影响。将3位酚羟基与戊二酸酐反应，在它的3位引入羧基，用于与大分子的缩合反应。水解速率测定用透析法，利用紫外吸收度衡量二氢埃托啡在透析过程中的含量变化。

R：CO(CH₂)₃COOH(Ⅰ)，CO(CH₂)₃CO-HAS(Ⅲ)，CO(CH₂)₃CO-PLL(Ⅳ)

图1二氢埃托啡与大分子的结合物

材料与方法

仪器为Zab Spec质谱仪，Carlo Erbo 自动元素分析仪，UV-260 紫外-可见光谱仪，IR-408 红外光谱仪，Monoscop H.Buck/Frankfurt 熔点仪，温度未经校正。

1盐酸二氢埃托啡的戊二酸单酯(I)的合成

盐酸二氢埃托啡0.1g(0.242 mmol)，戊二酸酐0.14g(1.2 mmol)溶于干燥的二甲基甲酰胺(DMF)中，加入几滴三乙胺，在80℃反应12 h后，再加入0.1g戊二酸酐，继续反应12 h。冷至室温后，加入10 ml水，滤集析出的固体，以活性炭脱色，硅胶干柱柱层析提纯，展开剂为含14％甲醇的三氯甲烷溶液，产率为68.2％；熔点：97～99℃；质谱分析：527(M+)，413(DHE)，395(DHE-H₂O)；380(DHE-H₂O-Me)；元素分析：C₃₀H₄₁NO₇^.H₂O；计算值：C 66.03％，H 7.93％，N 2.57％；测定值：C 65.65％，H 7.71％，N 2.37％。

2盐酸二氢埃托啡戊二酸单酯的活泼酯(II)的制备

盐酸二氢埃托啡戊二酸单酯23.33 mg，以4 ml干燥的DMF溶解，加入9.737 mg N-羟基琥珀酰胺，34.91 mg的DCC以及20 μl无水吡啶，在4℃搅拌24h，放于-20℃冰箱备用，或反应完成后离心分离后取上层澄清液放在-20℃冰箱中备用。

3盐酸二氢埃托啡戊二酸单酯与HSA的结合物(III)的合成

称取一定量的HSA(相对分子质量为68 000)溶于PBS溶液(0.1 mol/L,pH 7.4)中，加入一定体积的活泼酯溶液，搅拌，并用10％氢氧化钠溶液调节其pH值约为9，室温下反应4h。常压过滤去沉淀，滤液用G-25凝胶柱层析，洗脱剂为PBS(同上)，用紫外检测器监测洗脱液的组成。收集第一个峰下的洗脱液，透析2d后，冰冻干燥，测其紫外吸收度，计算结合比和回收率，不同的投料比得到不同的结合比。当HSA与盐酸二氢埃托的投料比（摩尔比）分别为1∶15， 1∶30，1∶60时，所得的结合物的比为1∶5，1∶8，1∶16，产率分别为79.2%, 80.0%,75.9%。

4二氢埃托啡与PLL(IV)的结合物

PLL^.HBr(相对分子质量为24 400)49.78 mg(0.003 mmol)溶于PBS (PH 6,0.1 mol/L) 2 ml中，戊二酸单酯溶于2 ml DMF, 再加入1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)， 搅拌，然后将此溶液加入到前面的溶液中，室温反应36 h后，再加入同量EDC，反应2.5h。过滤掉悬浮物，过G₂₅凝胶柱层析，洗脱相为pH 5.5的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，收集在紫外波长220 nm下的第一个洗脱峰。将洗脱液透析，冰冻干燥，计算回收率和结合比。所得结合比PLL∶DHE为1∶3。

5大分子结合物的水解速率的测定

称取一定量的大分子结合物置于透析袋中，加入5ml PBS (0.1 mol/L，PH7.4)使之全部溶解，将透析袋的口扎紧，放在25 ml PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)中，在37℃的恒温水浴中孵温，搅拌未开始时，测定透析袋外的溶液在220 nm处的紫外吸收度，作为空白值，在孵温过程中，在不同时间间隔测定透析袋外的溶液的紫外吸收度，以此作为指示浓度变化的定量手段。根据结合比计算所取结合物中所含DHE的量，配成30 ml溶液，测其紫外吸收度，作为水解终止的标志。计算结合物的水解百分率，水解曲线见图2。

图2HSA与盐酸二氢埃托啡的结合物（1∶17)

在PBS的水解曲线

6大分子结合物的药理性质

用小鼠热板法镇痛实验测定了各结合物的ED₅₀和t_1/2，阳性对照药为吗啡和二氢埃托啡, 阴性对照为生理盐水。测定了结合比为1∶5,1∶8,1∶16的HSA与盐酸二氢埃托啡的结合物，和PLL与盐酸二氢埃托啡的结合物的ED₅₀值和t_1/2。

结果

为延长盐酸二氢埃托啡的作用时间，利用它的3位酚羟基进行了结构改造，得到了盐酸二氢埃托啡与HSA（5∶1,8∶1,16∶1）和PLL（3∶1）的结合物，不同结合比的大分子结合物的水解曲线相似，经药理性质评价，效价降低，作用时间没有得到延长。1∶5，1∶8,1∶16的HSA∶DHE 结合物的ED₅₀分别为2.21,1.36, 0.61 μmol/kg，t_1/2均＜2h。PLL与DHE结合物的ED₅₀为0.035μmol/kg，t_1/2为2.2h。PLL∶DHE(1∶3)与HSA∶DHE(1∶5)相比, 前者的效价要高63倍，作用时间也较后者长。

讨论

1大分子结合物的体外水解反应

在pH 7.4，37℃的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲溶液中测定了3种结合比的大分子结合物中药物的释放快慢。不同结合比的大分子结合物的水解曲线相似，说明它们的结合比对水解速度几乎没有影响，这是因为大分子与盐酸二氢埃托啡分子之间的化学键相同，主要是它决定了水解的快慢, 而游离的药物分子在相同的大分子骨架中的扩散速率相同。图2是结合比为17的大分子结合物的水解曲线，它综合反映了水解反应和扩散释放药物的快慢。

2大分子结合物的药理性质

从盐酸二氢埃托啡与HSA的结合物的ED₅₀值来看, 它们都比DHE的ED₅₀值大，药效时间小于2h，这可能是因为盐酸二氢埃托啡与高聚物HSA，PLL结合后大大增加了药物分子的体积和水溶性，因而不易进入中枢神经系统的脂质细胞，且用皮下给药方式，不利于它们在体内的转运和透过血脑屏障，只有被水解出的原形药才能发挥作用，降低了效价，而没有达到延长作用时间的目的。PLL∶DHE(1∶3)与HSA∶DHE(1∶5)相比,前者的效价要高63倍，作用时间也较后者长，说明PLL与HSA对提高盐酸二氢埃托啡的生物利用度的效果不同，这反映了聚合物骨架的性质对药物释放速率有影响。因此，如果采用骨架上带有脂溶性较大的基团的高聚物，使整个分子的脂溶性增加，在血液中的降解速率减小，持续释放游离药物进入中枢神经系统，则有可能达到延长药物作用时间的目的。

致谢：化合物的质谱和元素分析由本院仪器中心的武力民、金人慈老师完成，药理实验由本所王丹心博士主持完成，特向他们表示衷心感谢。

作者单位：军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850

参考文献

［1］Portoghese PS.The role of concepts in structure-activity relationship studies of opiod ligands.J Med Chem,1992,35(11)∶1927

［2］Negishi N,Bennett DB,Cho CS，et al.Coupling of naltrexone to biodegradable poly(α-Amino Acids).Pharm Research,1987,4(4)∶305