中国微生态学杂志2000年第12卷第2期

江滟王和易旭

摘要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的CWDMs及其亲代细菌型和伤寒杆菌粗糙型的乳酸脱氢酶(LDH)同功酶，以了解沙门菌CWDMs生物氧化的特点和机制，探讨CWDMs变异的性质。结果表明，伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的细菌型及伤寒杆菌粗糙型在聚丙烯酰胺凝胶电泳后显示出相同的4种具有不同泳动速率的LDH同功酶，但CWDMs仅显示2种LDH。CWDMs的2种LDH同功酶与其亲代细菌型及伤寒杆菌粗糙型的2种快泳动的LDH相同，但缺乏慢泳动的2种LDH同功酶。提示CWDMs不能酵解糖类以及只能在有氧环境中利用丙酮酸生长繁殖的特性可能与其丧失了2种慢泳动的LDH同功酶有关。

关键词：沙门菌乳酸脱氢酶同功酶细胞壁缺陷突变株

沙门菌属的细菌具有活跃的代谢活动，其不但能够在有氧环境中代谢多种糖类和蛋白质，而且也能够在厌氧环境中利用这些营养物质生长繁殖。如同其他细菌或生物细胞一样，沙门菌也能够利用糖类产生乳酸或丙酮酸，然后通过厌氧的酵解途径或需氧的氧化磷酸化途径进一步分解而获得能量。但文献^［2］报道，沙门菌等多种细菌丧失细胞壁成为稳定L型后，即随之丧失了对糖类的酵解活性和在厌氧环境中不能生长。已知乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH) 能够催化丙酮酸与乳酸之间的相互转化，具有多种不同的类型或同功酶。LDH广泛存在于真核生物细胞及原核生物细胞内，对宿主细胞利用糖类等营养物质进行厌氧酵解和需氧氧化磷酸化的代谢活动发挥着重要的调节作用^［4，5］。文献^［1］报道，根据LDH同功酶的相对比例对于某种组织细胞和组织细胞分化的每个阶段具有特征性。本文对伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌细胞壁缺陷突变株的LDH同功酶谱特点及其与其亲代细菌型和返祖菌的关系进行了比较分析，以进一步探讨沙门菌CWDM代谢的特点及其变异的生化机制，现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1菌株

1.1.1细胞壁缺陷突变株(Cell wall-deficient mutant, CWDM)用羧苄青霉素在高渗透压的LEM培养基上诱导伤寒杆菌(Salmonella typhi H901)和甲型副伤寒杆菌(Salmonella paratyphi A) 形成L型后，接种于非高渗透压培养基传代培养获得的稳定L型菌株。通过形态与代谢观察、抗原分析、菌体蛋白和外膜蛋白分析、染色体DNA内切酶谱、聚合酶链反应分析以及返祖试验，证实其与亲代伤寒杆菌或甲型副伤寒杆菌的同源性与差异。这些CWDMs在营养琼脂培养基上经每周或每月传一代，共传140代保存^［2］。

1.1.2粗糙型(Rough of S. typhi)以噬菌体转导试验从伤寒杆菌的CWDM获得的粗糙型菌株STR5、STR6，通过生化反应、抗原分析、聚合酶链反应鉴定这些粗糙型与其亲代伤寒杆菌的同源性与差异^［2］。

1.1.3细菌型(Bacterial form of salmonella)伤寒杆菌H901和甲型副伤寒杆菌(本室保存菌种)，通过生化反应，抗原分析和聚合酶链反应鉴定^［2］。

1.2培养基营养琼脂培养基，由卫生部上海生物制品研究所提供，按说明书配制。

1.3电泳分析技术分别收集6种菌的24小时培养物，用无菌双蒸水洗涤3次，以1∶20的比例加入0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液，以探头式超声破碎器分别破碎3min，并保持低温，低温离心10 000r/min,20min，取上清液冰冻保存备用。

按文献^［6］方法进行。采用垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳，以高pH不连续系统制备7.5%、pH8.9的凝胶及pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。上样液与0.1.%溴酚兰-50%甘油以5∶1比例混匀，每孔样品槽加入样品液20μl～25μl，恒流电泳3h～4h。

染色液配制：NAD(5mg/ml)2.5ml,NBT(1mg/ml)7.5ml.PMS(1mg/ml)0.5ml,1M乳酸钠2.5ml，0.5MTris缓冲液(pH7.0)3.7ml,0.1M NaCl 1.3ml,加双蒸水到25ml。电泳完毕后，剥离凝胶，立即放入染色液中，在37℃温箱内显色40min，双蒸水漂洗，7%醋酸固定保存并照相。

2结果

电泳和染色后，伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌细菌型、返祖菌及CWDMs都可见LDH同功酶带。细菌型和返祖菌有4条LDH同功酶带，其中泳动速率最慢的一条带(S1)染色深而粗，为主带。另一条泳动速率较慢的带(S2)和泳动速率快的2条带(F1，F2)染色浅而细。CWDMs仅有F1和F2，染色浅而细，泳动位置与其亲代菌和反祖菌的2条泳动速率快的同功酶带相同(图1)。

图1沙门菌CWDMs的LDH同功酶电泳图

1，2：伤寒杆菌粗糙型菌株3：甲型副伤寒杆菌CWDM4：甲型副伤寒杆菌5：伤寒杆菌CWDM6：伤寒杆菌

3讨论

乳酸脱氢酶(LDH)能够催化丙酮酸与乳酸之间的氧化与还原反应，是许多生物细胞内广泛存在的对糖类进行酵解和氧化代谢的重要酶类。已知LDH对乳酸或丙酮酸的催化活性与其组成成分A、B亚基有关，A亚基使LDH能够催化丙酮酸还原成为乳酸而促进糖的酵解代谢，B亚基则使LDH能够催化乳酸氧化成为丙酮酸而促进糖的氧化代谢^［7］。沙门菌是兼性厌氧菌，能够利用葡萄糖等糖类进行酵解和氧化。但伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌形成的CWDMs不但丧失了糖代谢活性，而且还成为只能利用乳酸或丙酮酸进行氧化代谢的专性需氧细胞。提示细胞壁缺陷可能导致沙门菌的糖代谢酶类发生了改变。本文结果显示，伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌均可检出4条相同的LDH带，而在CWDMs只发现2条相同的带。CWDMs丧失了2条慢泳动的LDH带而仅仅保留了与其亲代细菌型相同的2条快泳动的LDH带。提示在沙门菌的 4种LDH同功酶中，2种在PAGE电泳中泳动速度较慢的LDH可能与其糖酵解代谢活性有关，而2种在PAGE电泳中泳动速度较快的LDH则可能与其糖氧化代谢活性有关。CWDMs丧失了2种慢泳动的LDH但保留了2种快泳动的LDH，可能是导致其只能在有氧环境中生长繁殖和只能利用乳酸、丙酮酸及蛋白质进行氧化代谢的因素之一。

长期以来对于细胞壁缺陷是细菌的表型变异，还是涉及基因结构或功能改变的遗传性变异或突变存在着不同的看法和研究结果。文献^［2］报道，某些细菌的稳定L型可发生染色体DNA的丢失或限制性核酸内切酶图谱的改变。王和等^［3］证实，不能自发返祖的沙门菌稳定L型可通过与其亲代细菌型接触培养或噬菌体转导而发生返祖。本文结果显示，由伤寒杆菌CWDMs返祖的粗糙型伤寒杆菌不但恢复了其亲代伤寒杆菌所具有的各种代谢活性，而且也恢复了与其亲代伤寒杆菌一致的LDH同功酶。由于沙门菌的稳定L型返祖后都能够有规律地恢复与其亲代细菌型相同的各种代谢活性^［3］，因此沙门菌的CWDMs并没有丧失2种慢泳动LDH同功酶的基因，而可能是由于这些LDH基因不能表达所致。提示细胞壁缺陷细菌变异的机制不但有表型变异类型和染色体基因缺失突变，同时也还存在有染色体基因不能表达的变异类型。

作者简介：江滟(1976-)，女，助教，学士学位，主攻细菌的生理与致病性。

作者单位：江滟（贵阳医学院 微生物学教研室，贵州 贵阳550004）

王和（贵阳医学院 微生物学教研室，贵州 贵阳550004)

易旭（贵阳医学院 微生物学教研室，贵州 贵阳550004）

参考文献

［1］戴·罗伯底斯 EDP .细胞生物学［M］.中译第1版.河南：河南省科学技术情报研究所，1979，63.

［2］易旭，王和.沙门菌CWDMs用菌代谢检测［J］.中国微生态学杂志，1999，11(6)：349-351.

［3］王和，唐七义，徐英，等.伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的稳定L型返祖性研究［J］.贵州医药，1992，16(4)：197-199.

［4］DIXON M, et al. Enzymes［M］. New York: Academic Press, 1958.84-95.

［5］STEVEN S L， et al. J Bio Chem， 1983, 258-279.

［6］北京大学生物系遗传学教研室.遗传学实验方法［M］.北京：高等教育出版社，1983.147-156.

［7］陈思黎，李文杰.分子酶学［M］.北京：人民卫生出版社，1983.412-413.