第一军医大学学报1999年第19卷第4期

刘卉陈俊抛平井圭一

摘要目的:探讨学习与记忆是否与细胞色素P450 3A(CYP3A)的活性变化有关。方法：本文用红霉素N-脱甲基酶活性测定法分别检测了SAM-R₁和SAM-P₈组被促衰老小鼠（SAM）在7、13、36及84周龄时其肝微粒体细胞色素P450 3A的活性变化。结果：以SAM-R₁组为对照，随着年龄增长，SAM-P₈组中的CYP3A活性明显降低。结论：CPY3A的活性随着年龄增长对学习与记忆有一定的影响。SAM-P₈对研究有关人类衰老时记忆减退提供确实有效的动物模型。

关键词：细胞色素P450 3A（CYP3A）被促衰老鼠学习与记忆

被促衰老小鼠 (Senescence-accelerated mouse，SAM）是一种被加速衰老的小鼠模型，是由日本Takeda等^[1]制作。它包括促衰老倾向型(Senescence-accelerated prone mouse，SAM-P）和抗促衰老型(senescence-accelerated resistant mouse，SAM-R），后者显示正常年龄组特点。SAM-P由SAM-P₁、SAM-P₂、SAM-P₃、SAM-P₆、SAM-P₇、SAM-P₈、SAM-P₉、SAM-P₁₀及SAM-P₁₁组成；SAM-R则由SAM-R₁、SAM-R₄及SAM-R₅组成。从幸存者、生长率及Gompertzian作用的结果来看，SAM-P被认为是加速衰老的年龄模型。有资料表明SAM-P的早老表现：活性降低、毛发变粗及脱落提前、眼周损害、脊柱前或后突、淀粉样变性和骨质疏松症的发病率提高以及免疫作用的降低等^[1]。但这些病理表现在前9种SAM-P基质中各有不同。已证实SAM-P₈具有与年龄相关的学习与记忆能力衰退的特征^[2] 。CPY3A是肝脏混合功能氧化酶系（MFO）的主要成份，在内源性和外源性化合物的生物转化中起重要作用。作者主要目的是通过分别测定CPY3A在SAM-R₁及SAM-P₈肝微粒体中的活性变化，证实SAM肝CPY3A的活性是否随年龄的增长而降低，探讨其对学习与记忆的作用。

1 材料和方法

1 材料 实验动物为被促衰老小鼠（SAM），雄性，体质量100～150 g，实验分SAM-R₁和SAM-P₈二组，每组动物又分为存活期7、13、36和84周龄组。SAM-R₁组中7周龄鼠5只，13周龄6只，36周龄8只，84周龄7只；SAM-P₈组中各为4、7、6和5只。动物均由日本京都大学胸部疾病研究所老化生物学教研室提供。红霉素和NADPH为日本和光纯药业株式会社提供。

1.2 方法

1.2.1 肝微粒体制备 上述各组动物禁食24 h后断头处死，取出肝脏，放入试管内置于冰上。加4倍于肝重的0.25 mol/L蔗糖溶液制备匀浆，经1000 g离心10 min，4 ℃。将上清液收集于另一试管内置于冰上，在上述沉淀物中再加入4倍肝重的0.25 mol/L蔗糖溶液搅拌均匀，同样离心速度、时间及条件制得上清液，收集两次上清液于4 ℃ 12000 g离心15 min，再取上清液于400000g 4 ℃离心65 min。取沉淀物用0.15 mol/LKCl溶液制成匀浆，经400000g于4 ℃离心65 min，所得微粒体用新鲜配制的0.1 mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)稀释，Lorry法^[5]测定蛋白浓度。

1.2.2 肝微粒体细胞色素P450 3A活性测定 用新鲜配制的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)稀释肝微粒体，使蛋白终浓度为0.7～1.0 g/L，如此分别制备相同2份，取名为A、B两组。分别于A、B组中加入新鲜配制的0.1 mol/L红霉素及0.1 mol/L半尿素盐酸盐，使最终浓度分别为1mmol/L及1.25 mmol/L，再于A组中加入新鲜配制的0.1 mol/L NADPH，最终浓度为1 mmol/L；加10%三氯乙酸100 μl中止B组反应后再加0.1 mol/LNADPH，最终浓度亦为1 mmol/L，立即摇匀，同时配制作为标准曲线的C组，分别配制浓度为0.5、1.0及2.0 mmol/L甲醛溶液，取10⁴倍稀释后的甲醛溶液各为3、6、12 μl,分别加入0.1 mmol/L半尿素盐酸盐10 μl，10%三氯乙酸333μl及0.1 mmol/L Tris-HCl缓冲液各为654、651及645 μl，使三个试管总量各为1 ml。A、B、C三组充分摇匀置室温30 min后，A组加10%三氯乙酸100 μl中止反应，立即摇匀，A、B、C组全部2500r/min 离心10 min以沉淀蛋白。取上清液200 μl,按Nash法测定代谢产物甲醛生成量。再根据标准曲线求出肝微粒体细胞色素P450 3A的活性（mmol·min^-1.g^-1）。

2 结果

sAM-R₁与SAM-P₈组肝微粒体细胞色素P450 3A活性随年龄变化的比较见图1。

图1SAM肝微粒体中CYP 3A活性年龄变化的比较

Fig.1 Comparison of changes of CYP3A activity with ages in hepatic microsome in SAM

从图1可见，在SAM-R₁和SAM-P₈组中，CYP3A活性均随年龄增长而降低。SAM-R₁组的7至84各周龄组之间CYP3A活性变化不明显，经t检验，P＞0.05。SAM-P₈组中13周龄组CYP3A活性降低显著，下降约34%，t=3.04，P＜0.01；比较13周和36周龄组则下降约35%，t=3.274，P＜0.005；36至84周龄组降低约87%，t=2.27，P＜0.02。可见，随着年龄增长，CYP3A活性在SAM-P₈各周龄组中有不同程度的降低，而在SAM-R₁组则变化不明显。

在同龄组内比较发现，7周龄鼠SAM-P₈与SAM-R₁两组的CYP3A活性差异较显著，t=1.988，P＜0.05；13周龄鼠SAM-P₈与SAM-R₁两组比较，t=2.415，P＜0.02，有显著差异；而36和84周龄鼠SAM-P₈与SAM-R₁两组比较分别是：t=2.714，P＜0.01和t=2.95，P＜0.02，均为显著差异。

3 讨论

实验证实，在SAM-R₁和SAM-P₈中，CYP3A的活性均随着年龄增长而降低，这与前面提到的药物动力学研究结果是一致的^[4]，其中在SAM-P₈中降低最明显，于SAM-R₁中变化不明显，这与SAM-P₈具有被加速衰老的特征，而SAM-R₁与具有正常年龄的特点相符合^[1]。在同一年龄组中SAM-P₈组CYP3A活性最低，以SAM-R₁组为参照，提示CYP3A对学习与记忆有一定的影响作用，SAM-P₈对研究有关人类衰老时记忆减退提供确实有效的动物模型。

作者简介：刘卉,女1970年出生,医师,电话85142699

作者单位：刘卉陈俊抛(第一军医大学珠江医院神经内科，广州，510282)

平井圭一(金泽医科大学解剖学第一讲座，金泽，日本)

参考文献

1 Takeda T，Hosokawa M，Takeshita S et al．A new murine model of accelerated senescence．Mech Ageing Dev，1981,17(1):183

2 Masaomi M，Yoshihiro K，Naoki Y et al．Phys Beh ,1986，38(2): 399

3 Schmncker DL，Wang RK．Age-related changes in liver drug metabolizing enzymes．Exp Gerontol ,1980，15(2): 321

4 Christine MH，Watkins PB，Paul Saenger et al．Effect of age and gender on the activity of human hepatic CYP3A．Bioche Phar，1992,44(2): 275

5 Lorry OH．Protein measurement with Folin phenol regent．J Biol Chem,1951，193:265