第四军医大学学报1999年第20卷第7期

李剑林树新李莹张莉莉

摘要目的：观察脂多糖(LPS)、N_W -Nitro-L-Arginine(L-NNA)和L-精氨酸对氯化钾(KCl)引起的血管平滑肌细胞(VSMCs) 收缩的影响，并分析一氧化氮(NO)在其中的可能作用.方法：离体培养SD大鼠VSMCs，采用微网法测量细胞收缩. 应用免疫组织化学方法观察一氧化氮合酶(NOS)在VSMCs中的表达.结果：0.5 g/L～1 g/L LPS可显著抑制KCl引起的VSMCs的收缩. 5×10^-4 mol/L L-NNA，5×10^-3 mol/L L-精氨酸单独作用对VSMCs的收缩无显著影响. 但NOS 抑制剂L-NNA（5×10^-4 mol/L）可拮抗LPS抑制VSMCs收缩的作用；L-精氨酸 (5×10^-3 mol/L) 可反转L-NNA的拮抗作用. 0.5 g/L～1 g/L LPS作用下，免疫组化显示VSMCs中有NOS的表达.结论：LPS对VSMCs的收缩具有抑制作用，这种抑制作用可能与LPS诱导VSMCs产生的NO有关.

关键词：脂多糖类血管平滑肌，细胞学一氧化氮合酶一氧化氮

0引言

低血压对血管收缩物质反应性降低，血管损伤，多器官功能衰竭等是内毒素休克的特征性表现，最后常因多器官功能衰竭而死亡^［1］，死亡率高达50%～70%，平均动脉压越低预后越差^［2］. 脂多糖(lipopolysaccharide , LPS)是内毒素的主要毒性成分，清除败血症休克血中的LPS后可获得良好的治疗效果. 本实验主要研究LPS对血管平滑肌细胞(VSMCs)收缩机能的影响，并初步探讨其机制，旨在为休克的临床治疗提供新的实验依据.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1动物SD大鼠，雌雄不限，体质量150 g～200 g，4 wk龄～8 wk龄. 由本校实验动物中心提供.

1.1.2主要试剂和药品RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）. 新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所， 批号 961003）. LPS，Nw-Nitro-L-Arginine (L-NNA)，L-精氨酸，胰蛋白酶（美国Sigma公司）. NOS兔IgG多抗（中山公司）. 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发公司）.

1.2方法

1.2.1VSMCs的培养大鼠腹腔麻醉后，无菌操作取出胸主动脉段，按消化法培养VSMCs^［3］ . 实验用原代细胞. 细胞纯度达90%以上.

1.2.2细胞收缩的测量^［4］将原代细胞悬液移入已置入玻片的75 mL培养瓶中，2 d～3 d可见细胞贴壁伸展. 待细胞完全铺满后，将小盖玻片随机分为3组～6组，每组3张. 加入不同药物继续培养24 h后，将贴有细胞的玻片夹出，PBS冲洗10 min×2，加入Krebs液于37℃ CO₂孵箱孵育15 min，吸弃Krebs液，再用PBS冲洗5 min×2，加入氯化钾(KCl)溶液，37℃ CO₂孵箱孵育5 min，弃KCl溶液，40 mL/L多聚甲醛固定10 min，PBS(pH 7.4)冲洗10 min×2. 各组小盖玻片经950 mL/L酒精5 min，HE染色，常规脱水，透明封固. 在光镜下观察各组平滑肌细胞的形态，用微网测量细胞的长度（以μm表示）.

1.2.3NOS免疫组化染色将细胞悬液移入已置入玻片的培养皿中，加入含小牛血清100 mL/L的RPMI-1640，培养24 h后，换成含小牛血清50 mL/L的RPMI-1640，同时加入不同浓度的LPS继续培养24 h后，将贴有细胞的玻片夹出，用PBS(pH 7.4)冲洗10 min×2，然后用40 g/L多聚甲醛固定10 min，再用PBS冲洗10 min×2，加入NOS兔IgG多抗，抗体效价1∶50. 4℃冰箱保存过夜. 再按试剂盒说明逐一加入其它试剂. 最后用DAB呈色. 系列浓度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固.

统计分析：实验数据以X±s表示，组间进行t检验.

2结果

2.1KCl对VSMCs收缩的影响将20 mmol/L～80 mmol/L KCl加至铺有细胞的玻片上，以微网法测量细胞收缩. 由Fig 1可以看出KCl可引起VSMCs的收缩，且随浓度的增大，收缩反应加强.

图 1不同浓度KCl引起的VSMCs的收缩反应

fig 1Dose-dependent response of VSMCs contraction induced by KCl(n=50)

^aP＜0.05,^bP＜0.01 vs control.

2.2LPS对VSMCs收缩的影响将0.5 g/L ～1 g/L LPS加至铺有细胞的玻片上，37℃ CO₂孵箱孵育24 h后，用80 mmol/L KCl刺激细胞收缩，观察LPS作用后细胞收缩能力的变化，以微网法测量细胞收缩. 由Fig 2可以看出LPS对KCl引起的VSMCs收缩有抑制作用. 0.5 g/L LPS组与1 g/L LPS组其收缩率较对照组分别降低28.9%和55.2%.

图 2LPS对KCl引起的VSMCs收缩的影响

fig 2Effect of LPS on the contraction of VSMCs induced by KCl (n=50)

^aP＜0.05,^bP＜0.01 vs control.

2.3L-NNA，L-精氨酸对LPS抑制VSMCs收缩的影响 L-NNA是NOS的抑制剂. L-精氨酸是NO的前体. 5×10^-4 mol/L L-NNA，5×10^-3 mol/L L-精氨酸单独作用后对KCl引起的VSMCs的收缩与对照组并无显著差别. 但把与上述同浓度的L-NNA和LPS（1 g/L）同时加至细胞培养片上时，L-NNA可拮抗LPS对VSMCs收缩的抑制作用（P＜0.05）. 当LPS，L-NNA和L-精氨酸共同作用时，L-精氨酸 (5×10^-3 mol/L) 却可反转L-NNA的拮抗作用（P＜0.05）(Fig 3).

图 3L-NNA和L-精氨酸对LPS抑制VSMCs收缩的影响

Fig 3Effect of L-NNA and L-arginine on the LPS induced inhibition of VSMCs contractility(n=50)

^bP＜0.01 vs control ;^cP＜0.05 vs LPS group ;^e P＜0.05 vs LPS+L-NNA group.

2.4NOS免疫组织细胞化学把长有细胞的玻片分为未加药的对照组和1 g/L LPS处理组，每组3张玻片. 按试剂盒说明染色，结果对照组呈阴性，仅见苏木素衬染后的蓝色胞核，胞浆不着色. 1 g/L LPS组呈阳性，棕色的NOS免疫反应产物位于胞浆，核呈空泡样，不着色.

3讨论

血管对收缩性血管活性物质反应性降低，从而导致持续性低血压，是内毒素休克死亡的重要原因之一. 我们在实验中观察到LPS（0.5 g/L ～1 g/L ）显著抑制VSMCs的收缩. 在其机制分析中，本实验进一步观察到，NOS抑制剂L-NNA（5×10^-4 mol/L）单独作用时对VSMCs的收缩无显著影响. 而与LPS（1 g/L）合用时，L-NNA可拮抗LPS对VSMCs收缩的抑制作用. NO前体L-精氨酸（5×10^-3 mol/L）单独作用时对VSMCs的收缩亦无明显影响，但与LPS（1 g/L）和L-NNA（5×10^-4 mol/L）合用时，L-精氨酸可反转L-NNA的拮抗作用. 同时免疫组化显示正常VSMCs中无NOS的表达，而LPS作用下出现NOS的阳性表达. 该结果提示，LPS对VSMCs的收缩的抑制作用可能与内源性NO有关. 有文献报道NO通过环鸟苷酸(cGMP)发挥作用^［5］. NO生成后迅速与可溶性鸟苷酸环化酶的亚铁血红蛋白部分结合，导致cGMP升高，升高的cGMP可激活Na⁺-K⁺泵引起膜超极化^［6,7］或使钠钙交换增加；NO可增强肌质网钙泵的钙亲和力，而激活蛋白酶C的因子NO又可使钙泵活性达到最大^［7］；NO可使IP₃降低等多种途径使［Ca²⁺］_i下降而致平滑肌收缩减弱^［8］. 此外过量的NO还具有细胞毒作用直接损伤细胞；通过抑制磷酸烯醇丙酮酸的生成，而抑制糖异生^［9］；通过抑制线粒体中酶的活性，而抑制细胞的呼吸，降低能量的产生^［9］，以上各因素最终将导致VSMCs收缩能力下降. 但关于NO介导LPS抑制VSMCs收缩的具体机制还有待于进一步研究.

作者简介：李剑，女，1973-10-14生，山东省德州市人，汉族. 第四军医大学96级硕士生，已发表论文3篇. 导师林树新. 电话：(029)3374551

作者单位：第四军医大学基础部病理生理学教研室，陕西 西安 710033

参考文献

1 Natanson C, Hoffman WD, Suffredini AF et al. Selected treatment strategies for septic shock based on proposed mechanisms of pathogenesis. Ann Intern Med, 1994; 120(9): 771-783

2 Petros A, Lamb G, Leone A et al. Effects of a nitric oxide synthase inhibitor in humans with septic shock. Cardiovasc Res, 1994;28(1): 34-39

3 司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安：世界图书出版社，1996:186-194

4 张福琴，李志超