第四军医大学学报1999年第20卷第10期

赵英王文学董巨莹蒋宁

摘要目的： 观察蓖麻毒素（RT）修饰前后对小鼠肝脏毒性的影响.方法： RT用3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）一种异型双功能交联剂，进行化学修饰；生成RT的SPDP衍生物（PDP-R），测定两者在不同剂量和时间对小鼠肝脏还原型谷胱甘肽（GSH）含量的影响，以比较两者的毒性差别.结果： 随着中毒剂量的增加和时间的延长，两者均可使小鼠肝脏GSH含量下降（P＜0.01）,但RT组下降程度较PDP-R组更加明显（P＜0.01），表明PDP-R对小鼠毒性弱于RT.结论： 用SPDP修饰RT可降低其对小鼠的毒性，这对改进RT抗癌作用可能是一种有意义的尝试.

关键词:蓖麻毒素化学修饰3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯还原型谷胱甘肽小鼠

0引言

为探讨蓖麻毒素（RT）修饰前后活性的变化及其实际应用，我们采用异型双功能交联剂3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）对RT进行了化学修饰，得到其修饰物PDP-R. 有报道，PDP-R仍保留强抑瘤活性而部分毒性指标明显降低^［1，2］. 已知RT在小鼠体内可引起氧化作用，导致肝组织谷胱甘肽（GSH）水平降低^［3，4］，我们通过探讨RT及PDP-R对小鼠肝脏GSH水平的影响，来进一步判断RT修饰前后毒性的变化.

1材料和方法

1.1材料蓖麻毒素为本室提取纯化^［5］，经SDS-PAGE法鉴定为一条单带，M_r=65 000；SPDP为王文学教授制备，mp为80℃～81℃；PDP-R的制备参考文献［6］进行，每个RT结合PDP的平均个数为n=5.0；还原型谷胱甘肽（GSH，British）；5,5(-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB，上海生物化学研究所）；其它试剂均为国产分析纯. 健康昆明种小鼠，体质量18.5 g～22.5 g，雄性，为本校实验动物中心提供. 实验动物经颈椎脱臼法处死后，剖腹取出肝脏，冷生理盐水反复漂洗2次，吸干水分后，制成200 g/L匀浆缓冲液, 3 000 r/min离心5 min，取上清12 000 r/min离心10 min，取上清备用.

1.2RT和PDP-R对小鼠肝脏GSH水平的影响①GSH标准曲线的制作： 按文献［7］进行. ②剂量影响: 取50只小鼠，随机分成RT和PDP-R两大组，每大组25只，各大组再分成5个剂量小组，每小组5只，分别按2.5，5.0，7.5，10.0和15.0 μg/kg剂量腹腔注射给药. 另取10只小鼠给生理盐水作为对照. 注射药物后连续观察36 h，处死后测量肝脏GSH水平. 参考文献［5］进行. ③中毒时间影响: 取小鼠90只，随机分成RT，PDP-R和生理盐水正常对照组三个大组，每大组30只，各大组再分成5个时间点，即12，24，36，48和72 h组，每个时间点各6只小鼠，中毒剂量为10 μg/kg. 按上述方法取肝脏测量GSH水平.

2结果

2.1 GSH标准曲线见Fig 1.

图1谷胱甘肽标准曲线

fig 1Standard curve of glutathione

2.2中毒剂量的影响在相同条件下，不同剂量的RT和PDP-R对小鼠肝脏GSH的影响见Fig 2. 中毒后连续观察36 h，从Fig 2可以看出，随中毒剂量的增加，两组小鼠肝脏GSH水平均明显降低（P＜0.01），但RT组GSH降低的程度明显大于PDP-R组，其中2.5，5.0，7.5和10 μg/kg组RT与PDP-R对小鼠肝脏GSH水平有明显差异（P＜0.01或P＜0.05）.

图2蓖麻毒素及其衍生物（PDP-R）剂量对小鼠肝脏谷胱甘肽含量的影响

fig 2The effects of dose of ricin and its derivative on GSH content in liver of mice

^aP＜0.01 vs RT; ^bP＜0.05 vs RT (n=5, X±s_X).

2.3中毒时间的影响两组小鼠肝脏GSH水平随中毒时间的延长呈降低趋势（Fig 3），实验组在各时间点GSH水平均低于正常对照组（P＜0.01）. 实验组从中毒12 h开始出现差异，至36 h中毒小鼠肝脏GSH水平降低到最低值，以后开始缓慢回升. RT和PDP-R在中毒12 h差异不大，中毒24 h后，RT组引起的肝脏GSH降低明显大于PDP-R组（P＜0.01）. 至中毒后72 h，RT组开始有小鼠死亡，而PDP-R组小鼠均存活，仅有中度的腹泻.

图3蓖麻毒素及其衍生物(PDP-R)中毒时间对小鼠肝脏谷胱甘肽含量的影响

fig 3The effects of time on GSH content in liver of mice intoxicated by ricin and its derivative (PDP-R)

^aP＜0.01 vs control; ^bP＜0.05 vs PDP-R (n=5,X±s_X).

3讨论

还原型谷胱甘肽（GSH）是机体组织抗氧化系统的重要一员，是细胞中含量最多的非蛋白巯基化合物，参与细胞的防御机制、细胞解毒及细胞的损伤修复. 检测其在细胞内的含量变化，可用来判断抗肿瘤药物对肿瘤及其宿主的毒性程度^［8］. 我们用SPDP对RT进行化学修饰，得到PDP-R. 本实验结果表明：虽然PDP-R对小鼠肝脏仍具有一定的毒性作用，但明显弱于RT；两种药物均表现出较好的剂量和时间效应： ①中毒36 h内，小鼠肝脏GSH含量随两种药物剂量的增大而逐渐降低，但PDP-R组降低的程度明显小于RT组（P＜0.01），当剂量达到LD50值（15.0 μg/kg），两种药物的差异不显著； ②由于RT具有强毒性，考虑到当给药剂量较大时，可能由于实验组老鼠的死亡增多而影响统计结果，所以我们选用略小于LD₅₀值的剂量来研究两种药物的时效关系. 从Fig 3可看出，当给药剂量为10 μg/kg（略小于LD₅₀值），药物的时效关系明显分为两个阶段：36 h以前，随时间的延长，小鼠肝脏GSH含量开始下降，但PDP-R组损伤较RT组轻，在中毒24 h, 36 h差异显著（P＜0.01）；36 h以后，由于是一次性给药，随药物代谢的完成，GSH合成的代偿性增加，GSH含量开始缓慢上升，但PDP-R组GSH的含量仍旧比RT组高，48 h两组差异明显（P＜0.01）；至中毒后72 h，RT组开始有小鼠死亡，而PDP-R组小鼠均存活；一次性给药，两种药物在中毒后36 h肝脏GSH水平均降至最低，这与已往报道的蓖麻毒素中毒损伤在24 h～36 h最为严重，中毒36 h氧化损伤程度达到最大相一致^［4］.

由上述，用SPDP修饰RT，无论从剂量还是时间效应看，修饰产物PDP-R对肝脏的毒性作用均小于RT，这可能是由于：①RT与SPDP基团结合，改变了RT与半乳糖结合位点的空间构型，降低了RT对半乳糖或其残基的结合活性，从而降低RT对正常细胞包括肝细胞的毒性^［1］；②因为1个RT分子平均引入了5个对巯基（-SH）具有敏感而专一结合的吡啶二硫基（PDP）基团，而血液循环系统中的红细胞等细胞表面及某些蛋白质分子中富含—SH，使得PDP-R在进入机体后，通过二硫键与之结合，同时此二硫键的结合是可逆的，因此PDP-R可被一定程度的滞留在血像中，相对减少了进入肝组织的毒素水平，从而降低了对肝脏的毒性作用. 另有报道^［9］，体内的某些肿瘤组织细胞表面也富含-SH，PDP基团的引入可能增大RT与肿瘤细胞的结合. 所以用SPDP等含-SH结合基团的异型双功能交联剂修饰RT可能是一个改进RT毒性的新方法，有关研究将继续进行.

基金项目：国家自然科学基金资助项目No. 3870638

作者简介：赵英， 男, 1973-05-25生， 陕西西安人， 汉族. 1996年第四军医大学毕业，硕士，发表论文1篇. 电话:（029）3372185

作者单位：第四军医大学军事卫勤统计系毒理学教研室，陕西 西安 710033

参考文献

1 王文学，董巨莹，李霖et al． 蓖麻毒素修饰物结合半乳糖和凝血活性的改变． 解放军医学情报，1994；8(5)：269

2 李霖，王文学，邹伯英． 蓖麻毒素修饰物制备和细胞毒作用． 第四军医大学学报，1996；17（3）：178-180

3 Muldoon DF，Stohes SJ． Ricin-induced oxidative stress in mice．Toxicologist，1991; 11:214

4 Muldoon DF， Hassoun EA， Stohs SJ． Ricin-induced hepatic lipid peroxidation，glutathione and DNA single-strand breaks in mice． Toxicon，1992;30(9):977-984

5 王文学，郭正仁． 简便经济的蓖麻毒素提取方法．第四军医大学学报，1985;6(2):153

6 Wang WX，Dong JY，Zhou SY et al． Modification of ricin and its hepatotoxicity and activity against hepatocellular cancer in mice. World J Gastroenterol， 1998；4(4):307-310

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